背景和目的前列腺癌是男性发病率第二的肿瘤,仅次于第一位的肺癌,其死亡率在男性恶性肿瘤中排第五位。近二十年来,中国前列腺癌的发病率明显升高。虽然前列腺癌在诊疗上取得了很大进展,但是,临床工作中关于前列腺癌的恶性程度与预后判断缺乏有效的检测指标,而且,多数患者在历经一段有效的雄激素阻断治疗阶段后,最终演变为去势抵抗性前列腺癌,目前的治疗方法效果有限,如何控制雄激素非依赖前列腺癌进展,是泌尿系肿瘤领域众所周知的难题。ELL2(eleven-nineteen lysine-rich leukemia 2)是ELL家族中重要的一员,作为SEC(super elongation complex)超级延伸复合体的主要成分,它与结合因子EAF1(ELL-associated factor 1)、EAF2(ELL-associated factor 2)等共同形成超级延伸复合体,作用于RNA聚合酶II,调节转录延伸速度。真核细胞转录调节异常是人类诸多疾病的原因,该领域是近年来的研究热点。ELL2作为ELL蛋白家族中的一员,与ELL类似,它同样可结合RNA聚合II,加快转录延伸速度,但ELL2表达或功能的异常是否同样参与了前列腺癌的发生发展过程,目前尚未见报道。肿瘤的发生是多种致病因子共同作用的结果,其中重要的一点是细胞脱离正常生长周期的调控,表现为过度增殖倾向,而且,肿瘤细胞逃逸正常免疫系统的监视,其程序性死亡(凋亡)的调控出现异常,呈现出永生化倾向。细胞凋亡率降低是肿瘤形成和发展的重要因素之一,调控细胞凋亡信号通路的主要有以下两条:细胞外死亡诱导信号如Fas配体和Fas受体信号通路以及细胞内固有的凋亡通路(即程序性细胞死亡通路)。两者最终都通过激活胞内休眠的蛋白酶起作用,如caspase蛋白家族。前期的研究发现,在前列腺增生组织中,ELL2表达水平上调,但是,ELL2是否对前列腺癌细胞的增殖与凋亡有调控作用,尚不十分清楚。造成前列腺癌的预后不良的另外一个原因是其转移和进展。在肿瘤细胞迁移和侵袭的过程中,基质金属蛋白酶(MMPs)起着主要作用,MMPs可以降解细胞外基质(ECM),提高肿瘤细胞的侵袭力,尤其是MMP1、MMP2、MMP3和MMP9等。此外,细胞黏附分子,如细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)等在肿瘤细胞迁移中也起一定作用。ELL2对于前列腺癌细胞侵袭与迁移能力的影响也有待于实验证实。真核细胞内的大多数蛋白质通过泛素-蛋白酶体途径降解,泛素化是蛋白质翻译后修饰的过程,对蛋白活化、浓度调节、降解都发挥重要作用,如果需要上调靶蛋白水平,阻止其泛素化降解是一种重要方法。每个蛋白都在特定的赖氨酸位点与泛素结合,称之为泛素化位点,如果其他因子与该位点的赖氨酸竞争性结合,可阻止该蛋白降解。泛素结构高度保守,性状稳定,其多样性的基础是与靶蛋白结合后通过泛素自身的不同赖氨酸残基(Lys-residues)或氨基端(amimo terminus),形成结构与功能迥异的泛素聚合体。在一系列酶的作用下,靶蛋白与泛素链的复合体进入蛋白酶体内的催化中心,靶蛋白被降解,泛素单体再次游离,与下一个靶蛋白结合,循环往复。泛素的赖氨酸残基有7个,它们形成了不同的泛素链,目前研究较清楚的是Lys48在蛋白酶体途径的泛素化降解中起到重要作用,Lys63在细胞内信号传导中扮演重要角色。但是,还有5个赖氨酸残基参与形成的泛素链功能尚未明确,被称作“反常的泛素赖氨酸残基”,它们是Lys6,Lys11,Lys27,Lys29,Lys33,而且,研究者发现这些反常泛素链的形成与靶蛋白诸多细胞功能相关,是近期研究的热点。有研究表明,下调泛素连接酶Siah可稳定ELL2蛋白在体内的水平,从而保证ELL2构建超级延伸复合体并参与RNA聚合酶的转录调控过程。但ELL2经泛素化途径降解的具体分子机制仍需进一步探讨。本课题首先以临床患者前列腺的病理标本为研究对象,应用免疫组化技术检测人体前列腺癌组织与正常前列腺组织中ELL2表达差异,观察随着前列腺癌的恶性程度增高,ELL2表达趋势的改变;继而以前列腺癌C4-2细胞为研究对象,分别瞬时转染ELL2-si RNA下调ELL2基因表达与Flag-ELL2质粒上调其表达,利用MTT实验、流式细胞技术、Transwell小室技术等观察对前列腺癌细胞增殖能力、凋亡率、侵袭力与迁移的影响;利用Western-Blot观察增殖相关蛋白PCNA、凋亡基因caspase-3与PARP、侵袭性与迁移能力相关因子MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、N-cadherin、E-cadherin和ICAM-1蛋白表达变化的表达变化,探讨ELL2可能在前列腺癌发生发展中的作用及分子机制。关于ELL2泛素化相关研究:以前列腺癌C4-2细胞为研究对象,通过降解时间对比与免疫共沉淀实验证实ELL2是通过泛素-蛋白酶体途径降解的蛋白。应用质粒重建与点突变技术,鉴定ELL2泛素化位点。以293细胞为研究对象,把EAF1、EAF2分别与ELL2共同瞬时转染后通过降解时间对比与泛素化免疫共沉淀实验鉴定EAF1与EAF2是否影响ELL2降解。最后,将ELL2与野生型泛素或不同的泛素赖氨酸残基突变体共同转染,免疫共沉淀实验鉴定参与ELL2泛素化的泛素赖氨酸残基。本研究探索ELL2在前列腺癌中的作用,为调控ELL2在细胞内的蛋白浓度,进一步研发治疗前列腺癌的靶点与药物奠定基础。方法1.ELL2在前列腺癌中的表达及其对前列腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响1.1 ELL2在前列腺癌中的表达分别收集临床前列腺癌组织29例及正常组织22例,免疫组织化学方法检测ELL2在这两种不同组织中的表达情况。1.2雄激素作用下对前列腺癌细胞ELL2表达的影响用人工合成雄激素R1881刺激前列腺癌细胞株LNCa P和C4-2,Western blot和Real-time PCR检测不同浓度及不同作用时间R1881对ELL2的影响。1.3 ELL2对前列腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响分别用ELL2-si RNA和Flag-ELL2质粒转染前列腺癌C4-2细胞,应用MTT方法检测细胞增殖率的变化;应用流式细胞技术检测细胞凋亡率的变化;Western blot方法检测增殖细胞核抗原PCNA及凋亡蛋白Caspase3、PARP的变化;应用Transwell小室检测细胞侵袭、迁移能力的改变;Western blot方法检测MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、ICAM-1、N-cadherin和E-cadherin的表达变化。2.ELL2泛素化降解关键片段、位点的研究;EAF1/EAF2对ELL2降解的影响;参与ELL2降解的泛素赖氨酸残基的研究2.1 ELL2蛋白稳定性的检测用人工雄激素R1881刺激前列腺癌C4-2细胞表达ELL2蛋白后,应用CHX抑制蛋白合成,Western blot检测每小时ELL2蛋白水平,连续5小时;分别用C4-2细胞及转染ELL2的293细胞,检测蛋白合成抑制剂CHX及蛋白酶体抑制剂MG132对内源性及外源性ELL2降解的影响。2.2 ELL2泛素化途径降解及降解片段、位点的检测Flag-ELL2与HA-Ub质粒共转染293细胞,MG132抑制蛋白酶体功能,应用抗Flag的琼脂糖珠做免疫共沉淀实验,Western blot检测泛素表达情况;之后,将不同ELL2片段的Flag载体重组质粒(片段1:aa1-aa292,片段2:aa293-aa531,片段3:aa532-aa640)转染C4-2细胞,应用CHX抑制蛋白合成后,Western blot检测各片段4h、8h、12h、24h与1h、2h、3h、4h时间点Flag表达水平,对片段3加测15min、30min、45min、60min、75min时间点Flag表达水平;最后,将ELL2片段3(aa532-640)所包括的9个赖氨酸,均制备Flag载体K/R点突变质粒并转染C4-2细胞,应用CHX抑制蛋白合成,Western blot检测时间点0、6h、12h、24h的ELL2蛋白水平的变化。2.3 ELL结合因子EAF1/EAF2对ELL2降解影响的研究Flag-ELL2分别与Myc-Vector、Myc-EAF1与Myc-EAF2共同转染293细胞,应用CHX抑制蛋白合成,Western blot检测0h、6h、12h、24h ELL2蛋白水平;之后,将Flag-ELL2与HA-Ub共转染至293细胞后,再分别转染Myc-Vector、Myc-EAF1与Myc-EAF2,应用MG132抑制蛋白酶体,抗FLAG琼脂糖珠行免疫共沉淀实验,利用Western blot方法检测泛素与ELL2水平。2.4 ELL2泛素化降解的泛素赖氨酸位点的研究将野生型泛素质粒和不同的泛素赖氨酸残基突变体(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)与Flag-ELL2共转染至293细胞,应用MG132抑制蛋白酶体,抗FLAG琼脂糖珠行免疫共沉淀实验,Western blot检测泛素与ELL2水平。结果1.ELL2在前列腺癌中的表达及其对前列腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响1.1 ELL2在前列腺癌中的表达降低免疫组化结果显示,与正常前列腺组织相比,前列腺癌组织中ELL2表达明显降低(P<0.05),且随着Gleason评分的增高,ELL2表达呈逐渐降低的趋势(P<0.01)。1.2 ELL2表现为雄激素依赖性Western blot和Real-time PCR结果显示,R1881刺激后,LNCa P和C4-2细胞中ELL2蛋白(P<0.05)及m RNA(P<0.05)水平均升高,且在一定范围内表现为剂量、时间依赖性。1.3 ELL2对前列腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响MTT结果显示,前列腺癌C4-2细胞在转染ELL2-si RNA后,细胞增殖率上升(P<0.001)PCNA在蛋白水平上升(P<0.05),而在转染Flag-ELL2后,增殖率下降(P<0.001),PCNA在蛋白水平下降(P<0.05);流式细胞仪结果显示,转染ELL2-si RNA组凋亡率下降(P<0.05),而转染Flag-ELL2组凋亡率升高(P<0.01),Western blot结果显示:转染ELL2-si RNA组Caspase3、PARP蛋白水平下降(P<0.05;P<0.01),而转染Flag-ELL2组Caspase3、PARP蛋白水平升高(P<0.001;P<0.001);Transwell结果显示,转染ELL2-si RNA组细胞侵袭、迁移能力均增加(P<0.01,0.05;P<0.01,P<0.05),MMP2、MMP3、MMP9蛋白水平均升高(P<0.01;P<0.01;P<0.01),N-cadherin、ICAM-1蛋白水平均升高(P<0.05;P<0.05),E-cadherin蛋白水平降低(P<0.05),而转染Flag-ELL2组细胞侵袭、迁移能力则下降(P<0.01;P<0.01),MMP2、MMP3、MMP9蛋白水平均下降(P<0.05;P<0.01;P<0.01),N-cadherin、ICAM-1蛋白水平均下降(P<0.01;P<0.05),E-cadherin蛋白水平升高(P<0.001)。2.ELL2泛素化降解关键片段、位点的研究;EAF1/EAF2对ELL2降解的影响;参与ELL2降解的泛素赖氨酸残基的研究2.1 ELL2是不稳定蛋白Western blot结果显示,应用CHX抑制蛋白合成后,ELL2蛋白水平逐渐下降,到5小时降至起点的20%以下;Western blot结果显示,无论是内源性还是外源性合成的ELL2蛋白,应用蛋白酶体抑制剂MG132后,ELL2蛋白水平均明显高于对照组(P<0.05;P<0.05)。2.2 ELL2经泛素化途径降解;片段3(aa532-aa640)对于维持其蛋白稳定性较重要;K571、K584、K599三个赖氨酸位点的突变有助于其维持蛋白结构的稳定性Flag-ELL2与泛素共同转染293细胞,应用抗Flag的琼脂糖珠做免疫共沉淀实验,Western blot结果显示,应用MG132抑制蛋白酶体后,在ELL2蛋白上方区域可见到明显的泛素条带,而对照组无泛素条带;不同片段的ELL2载体转染C4-2细胞后,Western blot结果显示,片段3(aa532-aa640)降解速度明显快于其他两段,75min时已经大部分降解;片段2(aa293-aa531)最稳定,12h时降解尚不明显;片段1(aa1-aa292)降解速度居中;不同位点的ELL2突变体转染至细胞后,Western blot结果显示,突变体K/R571、K/R584、K/R599的降解速度明显较野生型ELL2慢,其他突变体与野生型ELL2相似。2.3 ELL结合因子EAF1/EAF2有助于维持ELL2蛋白的稳定性与转染Myc空载体相比较,转染Myc-EAF1与Myc-EAF2均导致ELL2降解减慢。相比之下,转染Myc-EAF2对ELL2降解的影响更明显;并且,分别将Myc-EAF1、Myc-EAF2、HA-Ub与Flag-ELL2共转染293细胞后,应用抗Flag的琼脂糖珠做免疫共沉淀实验,Western blot结果显示,转染Myc-EAF1与Myc-EAF2的两组较转染Myc-Vector组泛素条带明显减弱,且ELL2对应条带明显增强。2.4有5个泛素赖氨酸位点参与ELL2的泛素化降解野生型泛素质粒和7个不同的泛素赖氨酸残基突变体分别与Flag-ELL2共转染293细胞后,应用抗Flag的琼脂糖珠做免疫共沉淀实验,Western blot结果显示,应用MG132抑制蛋白酶体后,K6、K11、K33、K48、K63均可见泛素条带,其中K63、K6、K48较强。结论1.ELL2在人体前列腺癌组织中表达降低,且与肿瘤恶性度相关。2.ELL2是雄激素反应蛋白,其表达的异常可能与去势抵抗性前列腺癌的进展相关。3.ELL2蛋白上调在一定程度上可抑制前列腺癌细胞的增殖,增加其凋亡率,并抑制其侵袭、迁移能力,ELL2参与了前列腺癌的发生发展过程。4.ELL2蛋白在体内经泛素-蛋白酶体系统降解,其与泛素结合位点主要在氨基酸片段aa532-aa640中,该片段在维持ELL2的稳定性上最为重要,K571、K584、K599三个赖氨酸是ELL2的泛素化位点;ELL的辅助因子EAF1、EAF2均可通过阻止ELL2泛素化而维持ELL2蛋白结构的稳定性。这些对ELL2蛋白结构的发现有助于调控ELL2细胞内水平,从而为治疗相关疾病提供分子水平上的依据。5.除K63及K48赖氨酸残基外,还存在多个泛素赖氨酸残基参与ELL2泛素化过程,提示ELL2可能与多种细胞功能有关。