Piezo1通过Ca2+/Calpain信号通路介导神经元缺氧/复氧损伤

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目的通过检测压电1型机械敏感性离子通道(Piezo1)在PC12神经元中的表达及其对细胞活力和凋亡的影响,研究Piezo1是否可以通过Ca2+/Calpain(钙蛋白酶)信号通路介导神经元缺氧/复氧损伤。方法1、取普通饮食野生型雄性SD大鼠脑组织,采用免疫组化及免疫荧光激光共聚焦显微镜检测Piezo1在大鼠大脑皮层中的表达及细胞定位。采用免疫荧光及激光共聚焦显微镜检测PC12细胞中Piezo1的表达及细胞内定位。2、PC12细胞氧糖剥夺/复氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)处理后,采用Western blot检测Piezo1的表达变化。将10只雄性SD大鼠随机分为Sham组(n=5)、MCAO组(n=5),采用Western blot检测大鼠受损大脑皮层Piezo1的表达变化。3、对OGD/R处理的PC12细胞,预先基于Piezo1激动剂Yoda1或拮抗剂Gs MTx4处理,采用CCK-8检测各组细胞活力,利用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测各组细胞的凋亡水平,利用荧光钙离子成像检测细胞内Ca2+浓度,Calpain试剂盒检测Calpain活性。4、对缺氧/复氧处理的PC12细胞,预先基于Piezo1拮抗剂Gs MTx4和/或Calpain抑制剂PD151746处理,采用CCK-8检测不同处理组细胞活力,利用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测不同处理组细胞的凋亡水平。结果1、免疫组化及免疫荧光结果显示,在普通饮食野生型雄性SD大鼠大脑皮层中存在大量Piezo1表达,并定位在内质网和细胞核;在PC12细胞中,也检测到了大量Piezo1表达,同时亦定位于内质网和细胞核。2、Western blot结果显示,缺血/再灌注后大鼠大脑皮层和缺氧/复氧后PC12细胞中Piezo1蛋白表达增加。3、Yoda1激活Piezo1可增强OGD/R诱导的细胞活力下降和凋亡增加,并使细胞内Ca2+浓度增加,Calpain活性增强。而Piezo1抑制剂Gs MTx4则具有相反的作用。4、Calpain抑制剂PD151746逆转了Piezo1激活对细胞活力和凋亡的影响。结论通过检测Piezo1在SD大鼠大脑皮层和PC12神经元中的表达及其对细胞活力和凋亡的影响,证实了Piezo1可以通过激活Ca2+/Calpain信号来调节神经元缺氧/复氧损伤。
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