第一部分肝脏癌前病变的发生机制研究研究背景和目的:世界卫生组织(World Health Organization,WHO)在1978年首次明确定义癌前病变(Precancerous Lesions)为“一种更容易发生恶性肿瘤的组织学改变”。癌前病变发生恶性肿瘤的风险显著高于其他组织,但并非所有的癌前病变均会进展为恶性肿瘤。高级别不典型增生结节(High Grade Dysplastic Nodules,HGDN)是肝癌的癌前病变,HGDN是指“肝组织有异型增生但又未达到恶性肿瘤标准,具有高度恶性潜能的,直径1mm以上的不典型增生结节”。HGDN是一种真正处于良恶性临界状态的肝组织,其进展为肝癌的风险显著高于其它非恶性结节,如增生性大结节(Large Regenerative Nodules,LRN)、低级别不典型增生结节(Low Grade Dysplastic Nodules,LGDN)等。据统计,HGDN患者发生肝癌的风险是LGDN的四倍,其五年内进展为肝癌的风险高达60-80%。由此可知,HGDN是调控肝脏恶性肿瘤发生的一个关键节点,如果能有效控制甚至逆转HGDN,那么就能大大降低肝癌的发病率。但是,目前与肝脏癌前病变相关的研究少之又少,其具体发生机制仍然鲜为人知。因此,我们希望通过对HGDN的形成,以及HGDN进展为肝癌的分子机制进行深入研究,寻找控制甚至逆转HGDN的分子靶标,以期最终能够降低肝癌的发病率。研究方法:1.精准获取临床HGDN组织样本:运用激光捕获显微切割技术(Laser Capture Microdissection,LCM)精准割取同一患者肝脏石蜡样本中的正常组织、HGDN组织和肝癌组织。2.HGDN组织中micro RNA表达谱鉴定:抽提LCM所获取肝组织中的micro RNA,利用micro RNA低密度表达谱芯片检测正常组织、HGDN组织和肝癌组织中的micro RNA表达特点;运用micro RNA动态网络标志物分析技术(Dynamic Network Biomarker Analysis,DNB)筛选出HGDN中异常表达的micro RNA。3.研究目标micro RNA在正常肝细胞恶性转化过程中的生物学功能:通过soft-agar克隆形成实验、皮下荷瘤实验、retrorsine小鼠肝细胞原位移植实验、分选DEN诱癌小鼠原代HGDN细胞荷瘤实验、尾静脉注射antagomir实验以及相关标志物检测等,深入研究目标micro RNA在肝细胞恶性转化过程中的相关功能。4.构建相关基因敲除小鼠并建立诱癌模型:我们构建了mi R-484组成型敲除小鼠(mi R-484-/-),并购买了Ⅰ型干扰素受体组成型敲除小鼠(Ifnar1-/-);通过对上述小鼠进行DEN诱癌,进一步研究mi R-484和Ⅰ型干扰素信号通路在肝脏癌前病变形成和肝癌发生过程中的功能及意义。5.机制探索:运用荧光定量PCR实验、报告基因实验、ELISA实验、Ch IP实验、相关抑制剂实验、基因敲除细胞实验以及敲除小鼠体内试验等,深入研究mi R-484调控肝细胞恶性转化和HGDN形成的具体分子机制。6.临床印证:通过一系列的免疫组化实验、ELISA实验以及原位杂交实验,印证本研究中相关基因在临床样本和小鼠DEN诱癌样本中的表达情况。研究结果:1.明确了肝脏癌前病变中micro RNA的表达特征,发现mi R-449b,mi R-545,mi R-484,mi R-320,mi R-625#,mi R-661和mi R-29a#等在HGDN中异常高表达。2.发现mi R-484能诱导正常肝细胞恶性转化并增强其成瘤能力。3.DEN诱癌时下调mi R-484能通过抑制癌前病变的形成影响肝癌的发生。4.mi R-484-/-小鼠DEN诱癌发现癌前病变的形成和肝癌的发生均显著减少。5.持续低剂量的Ⅰ型干扰素(IFN-I)依赖于mi R-484启动子区的H3K27高乙酰化(H3K27Ac)作用,选择性诱导mi R-484表达;而异常高表达的mi R-484能进一步诱导IFN-I生成,形成一个正反馈环路,最终促进肝细胞恶性转化。6.Ifnar1-/-小鼠DEN诱癌后,20周时,敲除组肝中mi R-484并未高表达,且其形成癌前病变明显少于野生小鼠;40周时,其肝癌的大小和数量也显著降低。7.在临床肝脏组织和血液样本中,mi R-484与IFN-I表达量相关。研究结论:本研究首次明确了肝脏的癌前病变HGDN中micro RNA的表达特征,发现了其中异常高表达的micro RNA。我们在动物水平和细胞水平证实:肝脏的慢性炎症或DNA损伤等诱导产生的低剂量I型干扰素,依赖于mi R-484启动子区H3K27Ac的作用,选择性诱导mi R-484生成;而异常高表达的mi R-484又能诱导IFN-I的生成,形成了一个正反馈环路,最终诱导正常肝细胞恶性转化,促进肝脏癌前病变的形成和肿瘤的发生。本研究首次发现低剂量的IFN-I具有促进HGDN形成和肝癌发生的作用,相关结果为控制甚至逆转肝脏的癌前病变HGDN提供了一些潜在的治疗靶标。第二部分CYP3A5在肝细胞癌中通过调控m TORC2/Akt信号通路发挥肿瘤抑制功能研究背景和目的:细胞色素P450家族通过对内源性或外源性物质的代谢在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用,其中CYP3A亚家族的作用尤为显著。CYP3A亚家族含量最多、底物谱很大,是代谢反应中最主要的限速酶之一。CYP3A亚家族包括4个主要成员,即CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43。由于CYP3A7主要存在于胎肝,而CYP3A43最近才被发现,故这两个成员的具体功能尚不明确;现今关于CYP3A亚家族研究最多的是它的两个主要成员:CYP3A4和CYP3A5。其中,CYP3A4在肿瘤发生发展过程中的生物学功能已经有较为充分的研究,它能活化前致癌物,且能参与抗肿瘤药物的代谢;而CYP3A5是研究得最深入的CYP3A亚家族低丰度成员,但是相关研究仍主要集中于肿瘤发生和药物代谢这两个方面,且相关研究主要是一些流行病学统计结果,对CYP3A5在肿瘤发展过程中的具体生物学功能则缺乏深入研究。研究方法:1.利用网络基因芯片公共数据库分析发现CYP3A5在癌和癌旁的表达水平差异。2.运用免疫组织化学染色方法分析CYP3A5原位表达差异,并根据组织芯片组化染色结果进行CYP3A5与临床-病理特征的相关性分析。3.利用临床肝癌标本和不同转移能力肝癌细胞系分析CYP3A5在不同转移能力肝癌组织和细胞株中的表达水平差异。4.肝癌细胞株过表达CYP3A5后进行迁移、侵袭、粘附等转移相关表型的体外、体内实验研究。5.利用免疫印迹、si RNA、免疫共沉淀、酶谱分析、免疫组化染色等技术,深入研究CYP3A5调控肝细胞癌侵袭转移的具体分子机制。研究结果:1.CYP3A5的表达水平在肝细胞癌组织中显著低于对应癌旁组织。2.CYP3A5表达水平的高低与肝癌转移潜能呈负性相关,且与预后直接相关。3.体外实验和体内试验同时证明,过表达CYP3A5能明显抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和粘附能力。4.CYP3A5通过抑制AKT信号通路活性,调节TIMP1、TIMP2的表达和MMP2、MMP9的活性。5.CYP3A5通过单纯阻断m TORC2激酶活性而非影响m TORC2复合物结构,选择性下调AKT的磷酸化水平(Ser473)。6.CYP3A5通过诱导产生细胞内高水平的ROS抑制m TORC2的激酶活性,进而抑制AKT(Ser473)活化,最终影响肝癌的转移相关表型。研究结论:本研究发现,CYP3A5表达水平在肝细胞癌组织中较癌旁组织明显下调。我们运用大样本的肝细胞癌组织芯片验证发现,这种表达差异与肝细胞癌的转移相关临床和病理指标存在显著相关性,即CYP3A5表达水平与肝细胞癌转移潜能呈负性相关。体外和体内实验进一步证明过表达CYP3A5可以显著抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和粘附能力,且这种转移相关表型的抑制作用主要是通过下调AKT信号通路活性,上调TIMP1、TIMP2表达水平和下调MMP2、MMP9的活性来实现的。通过深入的实验研究,我们发现CYP3A5介导的AKT(Ser473)活化减弱是m TORC2/p-AKT(S473)途径依赖的。同时,我们首次报道了CYP3A5通过诱导细胞产生高水平的ROS,从而在不影响m TORC2复合物稳定性的情况下单纯抑制m TORC2的激酶活性,最终抑制了p-AKT所介导的肝细胞癌侵袭和转移。