背景:实验证明缺血后处理(ischemic postconditioning,I-postC)可以明显对抗心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。药物性后处理在缺血后处理(I-postC)的基础上提出,既不损伤器官又能产生缺血后处理效应,更具临床应用价值。已有实验证明挥发性麻醉药如异氟醚、七氟醚后处理具有心肌保护作用,那么静脉麻醉药物异丙酚后处理是否具有心肌保护作用尚需研究证明。实验证明,异丙酚可以通过减少中性粒细胞集聚、改善冠状动脉内皮功能、减少活性氧的产生以及降低线粒体内钙浓度等途径保护心肌。近期研究发现主动效应在心肌保护作用中占据着更为重要的位置,细胞在受损同时,能够启动一系列主动效应,激发细胞本身的内源性抗损伤能力,增强细胞自我保护能力,称之为促生存效应。那异丙酚后处理是否通过激活心肌细胞自我保护机制,从而发挥促生存效应呢?本课题拟从细胞凋亡、细胞自噬以及促生存信号转导通路等方面对异丙酚后处理的心肌保护作用机制进行研究。第一部分心肌细胞培养以及缺氧复氧模型的建立及评价目的:探讨心肌细胞分离、纯化和培养方法;建立培养心肌细胞缺氧复氧实验模型并对其进行评价。方法:通过用改良的新生小鼠心肌细胞培养方法,选取新生1天内SD大鼠,采用胰蛋白酶和胶原酶共同消化的方法分离出心肌细胞,结合差速贴壁和化学试剂抑制法纯化。原代培养心肌细胞培养4天后,更换用无血清低糖培养基于常规培养箱中过夜同步化。造模前换用平衡过的无血清低糖的DMEM培养基培养,并置于厌氧培养箱或缺氧小室中培养。缺氧后,将细胞从厌氧培养箱或缺氧小室中取出,更换用含有血清的高糖DMEM培养基置于常规培养箱中培养4小时复氧。结果:原代培养心肌细胞呈岛屿状的自发性搏动,频率为90-150次/分。台盼蓝排斥实验证实心肌细胞成活率95.5%。心肌细胞内特异性肌动蛋白免疫细胞化学染色阳性表达率为95%。造模后心肌细胞均出现皱缩,搏动性降低等心肌细胞受损的特征性表现,随着缺氧时间的延长心肌细胞受损加重。3小时,6小时缺氧细胞受损不明显,但缺氧时间超过12 h时,细胞漂浮于培养基中造成较大误差,所以本实验的时间组别均设置12 h缺氧4小时复氧。结论:原代培养心肌细胞存活率高,纯度高符合实验要求。厌氧培养箱和缺氧小室均可模拟心肌细胞的缺氧环境,并且可以造成较为稳定的损伤。第二部分异丙酚后处理对抗心肌缺血再灌注损伤中ERK/NF-κB信号通路作用研究目的:应用原代培养心肌细胞缺氧复氧损伤模型,在心肌细胞复氧同时给予浓度梯度的异丙酚进行后处理,观察心肌细胞形态变化、凋亡情况以及ERK信号转导等方面研究异丙酚后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用并探索其促生存信号转导机制。方法:采用MTT法检测异丙酚后处理对缺血再灌注损伤心肌细胞活力的影响;采用流式细胞仪检测细胞内活性氧;采用流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC/PI双标法检测细胞凋亡率;Real-time PCR检测凋亡相关基因caspase-3 mRNA表达的变化;western blot检测ERK蛋白磷酸化表达水平变化;免疫荧光染色检测NF-κB亚基p65的核移位。应用ERK特异性抑制剂U0126对ERK磷酸化水平以及NF-κB亚基p65的核移位的影响。结果:MTT结果显示异丙酚后处理能够显著提高缺氧复氧心肌细胞活力且在50μM以下呈浓度依赖性,50μM以上细胞活力进入平台期。与此同时异丙酚后处理可以降低心肌细胞内的ROS水平。荧光显微镜下,正常培养心肌细胞无明显凋亡细胞,而缺氧复氧处理组可见部分细胞胞体缩小,胞质浓缩,可见典型的新月形的凋亡小体。相反在心肌细胞复氧同时给予异丙酚处理,可见镜下凋亡小体明显减少。流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双标检测凋亡率结果显示异丙酚后处理能够减少缺氧复氧所致的心肌细胞凋亡,早期凋亡细胞(AnnexinⅤ+/PI-)占总细胞数的比例减小,同时相应可抑制凋亡基因caspase-3 mRNA表达。western blotting的结果显示缺氧复氧心肌细胞组的磷酸化的ERK1/2表达量较正常对照组有微量上调,然而异丙酚后处理可以大幅度激活ERK/MAPK导致ERK的磷酸化蛋白表达增多,并且大部分依赖于异丙酚后处理的作用。ERK的特异性抑制剂U0126几乎可以完全抑制ERK1/2的磷酸化表达。缺氧复氧组中心肌细胞核中NF-κB p65蛋白表达量增多,异丙酚后处理组后,NF-κB p65蛋白发生核移位的细胞数减少比较明显。ERK的特异性抑制剂U0126可以消除异丙酚后处理对NF-κB p65核位移的抑制作用。结论:异丙酚缺血后处理对缺氧复氧心肌细胞有保护作用,可提高受损心肌的活力并减少凋亡心肌细胞数量以及抑制凋亡基因caspase-3 mRNA表达,其保护机制可能包括减低细胞内活性氧水平,抑制NF-κB亚基p65的核移位。同时,对于ERK/MAPK信号转导通路的研究表明异丙酚后处理的保护作用可能是通过激活ERK以抑制NF-κB核位移从而调控下游一系列信号转导和基因表达调控而实现的。第三部分异丙酚后处理中细胞自噬的保护作用以及相关JNK/MAPK信号转导研究目的:针对异丙酚后处理对抗心肌缺血再灌注损伤过程中细胞自噬机制及与细胞凋亡关系进行系统性研究。在心肌细胞复氧同时给予浓度梯度的异丙酚进行后处理,观察心肌细胞形态变化、细胞自噬与凋亡情况以及JNK信号转导等方面研究异丙酚后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用并探索其信号转导机制。方法:采用MTT法检测异丙酚后处理对缺血再灌注损伤心肌细胞活力的影响;采用流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC/PI双标法检测细胞凋亡率;Monodansylcadaverine (MDC)染色以及吖啶橙(Acridine orange,AO)染色检测细胞酸性空泡积聚情况;western blot检测异丙酚后处理对LC3I型向Ⅱ型转化的影响以及JNK蛋白磷酸化表达水平变化的影响;应用自噬抑制剂3-MA以及JNK抑制剂SP60125观察对心肌细胞自噬触发的影响。结果:应用Western blot检测LC3 I向II型转化的方法,目前也已基本成为检测自噬发生的金标准。MDC染色和AO染色作为辅助手段可以检测细胞中的嗜酸性小体,说明溶酶体活性上升,间接提示自噬的发生。这几个实验的阳性结果证明在缺氧复氧心肌细胞中,可以被异丙酚后处理诱导进一步发生细胞自噬。并且,从LC3 I向II型转化的趋势判断,自噬是随着异丙酚后处理的浓度梯度增强的。我们使用3-MA有效抑制心肌细胞发生自噬后,凋亡的的细胞由6.7%增加到15.6%。说明抑制自噬发生,可以对消除异丙酚后处理对心肌细胞的保护作用。异丙酚后处理在进一步激活细胞自噬的同时,JNK的磷酸化水平也得以提高,从而调控细胞自噬的发生与发展。磷酸化形式的JNK经异丙酚后处理之后,呈浓度梯度性增加,说明该通路被有效的激活。JNK特异性抑制剂SP600125处理后的心肌细胞,无论是Westem blot检测LC3 I至II型的转化,还是荧光显微镜下观察均说明了自噬被抑制。同时,在细胞自噬被抑制的同时,JNK特异性抑制剂SP600125也可以抵消异丙酚后处理对心肌细胞的保护作用,从而证明JNK信号通路介导了缺氧复氧心肌细胞内的细胞自噬。结论:实验证明异丙酚后处理可以激活心肌细胞自噬以激发心肌细胞内在的自我保护机制以减轻缺氧复氧损伤,并且证明了在缺氧复氧心肌细胞中细胞自噬的激活至少部分是由JNK信号转导通路介导的。对于自噬的分子机制的研究,将为围手术期心肌保护提供有利的思路。