核糖核苷酸还原酶（RNR）通过催化核糖核苷酸（NDPs/NTPs）还原形成相应的脱氧核糖核苷酸（d NDPs/d NTPs）,为DNA的复制和修复提供所需的前体。对RNR的研究有助于认识生命的本质。Id类RNR和Ie类RNR均为新发现的RNR亚类,它们的β亚基在结构和功能上均与先前已发现的亚类不同,而且均使用不同的自由基引发剂启动自由基传递。Ie RNR利用多巴自由基（DOPA·）作为自由基引发剂,但DOPA·的产生、传递和再生机理尚不清楚。Id RNR利用超氧化态的二锰辅因子(MnIII/MnIV)作为自由基引发剂,但MnIII/MnIV的结构以及自由基启动和传递的机理尚不清楚。揭示这两类RNR中自由基的产生、启动、传递和再生机理是研究RNR的核心内容之一,有助于对病原体的控制和抗病原体药物的开发。本实验室课题组通过铜（Cu（II））和锆（Zr（IV））与半乳糖氧化酶（GO）在PBS中配位而固定半乳糖氧化酶。Cu（II）和Zr（IV）协同催化分解副产物H2O2产生羟基自由基·OH和O2。实验发现固定半乳糖氧化酶的催化效率得到大幅度提高,而激活半乳糖氧化酶的机理有待深入研究和阐明。本论文通过分子动力学（MD）模拟、量子力学/分子力学（QM/MM）计算和密度泛函理论（DFT）计算,对Ie RNR和Id RNR酶中的自由基产生、启动、传递和再生机理以及对·OH和O2协同高效激活半乳糖氧化酶机理进行了研究,主要内容如下:（1）Ie RNR中DOPA·的产生、传递和再生机理研究。基于DFT模拟计算,首先研究了Tyr126被三电子氧化形成DOPA·的机理。研究发现,由黄素蛋白Nrd I产生的O2·-不能直接氧化Tyr126形成DOPA·,其作为氧化剂参与氧化反应之前必须质子化为HO2·。计算结果表明,Tyr126的共价修饰和DOPA·的生成可以在没有金属辅因子的参与下进行。进一步地,研究了DOPA·在DOPA126与Trp52之间的传递机理。结果表明,Lys213是实现DOPA·传递的关键氨基酸。Lys213的ε-氨基不仅作为电子转移的桥梁,还作为质子供体通过水分子向DOPA126提供质子,从而促进了DOPA126和Trp52之间的自由基传递。研究发现Asp88的质子化是DOPA·产生和传递的前提。最后,开展了自由基再生机理研究。发现自由基一旦被淬灭,可以通过O2·-或HO2·的氧化得到再生。（2）Id RNR中自由基启动和传递机理研究。基于DFT和电子顺磁共振谱（EPR）的模拟计算,首先确定了Id RNR的二锰辅因子在超氧化态（活性）下的结构为MnIII-（μ-oxo）2-MnIV（配合物2）和MnIII-（μ-hydroxo/μ-oxo）-MnIV（配合物1）。配合物1是配合物2的单质子化态。然后,基于确定的二锰辅因子结构,揭示了Id RNR中自由基的启动和传递机制。计算发现,配合物2中的二锰辅因子团簇MnIII-（μ-oxo）2-MnIV没有足够的还原电位直接启动自由基的传递,在传递前它需要先通过单质子化转化为MnIII-（μ-hydroxo/μ-oxo）-MnIV（配合物1）。桥联配体μ-oxo的质子化状态可以通过β亚基与α亚基的聚集和分离引起的蛋白质微环境变化来调节。在配合物1中,二锰辅因子团簇MnIII-（μ-hydroxo/μ-oxo）-MnIV与Trp30之间的自由基传递是水介导的三质子耦合电子转移过程（t PCET）。它经过三步反应,通过水分子W551和桥联配体μ-hydroxo将质子从Lys71的ε-氨基转移到Glu97的羧基。在Id RNR中新发现的质子耦合电子转移机制与已知的Ia-Ic RNR中的机制不同。Lys71的ε-氨基作为质子供体,在自由基传递过程中起着重要作用。（3）·OH和O2协同高效激活半乳糖氧化酶（GO）的机理研究。基于DFT模拟计算,首先研究了·OH激活GO的机理。·OH可将活性位点还原态的配合物ECu（I）/（Cys-Tyr）氧化为活性态ECu（II）/（Cys-Tyr）·,以及将非活性的中间体ECu（II）/（Cys-Tyr）氧化为活性态ECu（II）/（Cys-Tyr）·。计算结果表明,·OH作为单电子氧化剂可以通过将活性位点恢复到活性态ECu（II）/（Cys-Tyr）·而激活GO。基于DFT模拟计算,研究了O2作为双电子氧化剂将活性中心还原态ECu（I）/（Cys-Tyr）氧化为活性态ECu（II）/（Cys-Tyr）·,同时O2被还原为H2O2的机理。研究结果表明,·OH激活GO与O2还原半反应高度相关[O2→H2O2→（·OH+O2）]。