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乳腺是雌性哺乳动物分泌乳汁哺育后代的重要器官,乳腺在胚胎时期形成初步的树状导管结构。直至青春期受激素影响再次开始发育,到性成熟形成完整的乳腺导管分布于整个脂肪垫。怀孕期,乳腺开始进一步发育,形成乳腺小叶和泌乳腺泡,分泌乳汁哺育幼仔。到哺乳期结束,乳腺退化并恢复到怀孕前的状态。乳腺是一个在出生后完成大部分发育过程的器官,因此乳腺是研究发育及成体干细胞行为的重要模型。microRNA(miRNA)是一类内源的,由约20-23个核苷酸组成的非编码单链RNA,主要在动植物机体内转录后调控基因表达。近年来,许多体外研究表明多种miRNA参与乳腺发育过程,调控乳腺发育模式,参与乳腺上皮细胞增殖、分化、凋亡等过程。然而,单个miRNA在乳腺发育和乳腺干细胞调控中的体内研究还未见报道。本研究发现miR-31的表达水平随乳腺发育进程而动态变化。从青春期到成年期miR-31的表达水平逐渐增高,怀孕中期达到顶峰,泌乳结束乳腺退化时miR-31的表达水平明显回落。miR-31在乳腺发育不同时期的表达模式预示着其表达水平可能与激素调控相关。利用生物信息学方法分析发现miR-31启动子含有NF-κB的结合位点,利用染色质免疫共沉淀方法证实了 NF-κB直接结合miR-31的启动子区并调控miR-31的表达。进而,发现孕激素可以通过激活NF-κB信号调控miR-31的表达。为了揭示miR-31在乳腺发育中的功能,本研究分别建立了miR-3 全身敲除小鼠和乳腺上皮细胞特异性敲除(K14-Cre/miR-31f/f)小鼠。研究发现miR-31敲除后乳腺在青春期出现怀孕早期的表型,表现为出现大量三级分支,预示着miR-31可以阻止乳腺发育的早熟。在怀孕中期,miR-31敲除的乳腺泌乳小泡提前分化,乳腺腺泡发育不充分,导致在泌乳期乳腺泌乳量减少,不能正常哺育幼仔。进一步研究发现miR-31敲除是通过提前激活STAT5信号活性,降低P-Cadherin表达水平促进分化,抑制增殖而导致泌乳小泡发育异常。流式细胞分析结果显示miR-31敲除后导致乳腺上皮干细胞(MaSCs)比例显著下降,乳腺干细胞异体移植实验显示乳腺干细胞重建乳腺的能力受到抑制。这些结果表明miR-31促进乳腺干细胞的自我更新。在分子机制上,利用miRNA靶基因预测软件发现Wnt信号通路负调控因子Gsk3β,和TGF-β信号通路重要基因Smad3和Smad4的3’ UTR区都含有miR-31结合位点。利用qRT-PCR、Western Blot和双荧光素酶活性实验证实Gsk3β,Smad3和Smad4是miR-31的直接靶基因。由此可见,miR-31通过抑制Gsk3β激活Wnt信号通路,同时负调控Smad3和Smad4而抑制TGF-β信号通路。综上所述,在乳腺上皮细胞中NF-κB信号通路介导孕激素对miR-31表达的调控。MiR-31通过转录后调控Gsk3β激活Wnt信号通路,负调控Smad3和Smad4而抑制TGF-β信号通路,促进乳腺干细胞增殖和自我更新,抑制分化,防止乳腺早熟。本研究提出了NF-κB-miR-31-Wnt和NF-κB-miR-31-TGF-β信号通路在乳腺发育中发挥重要作用,丰富了乳腺发育的分子信号调控网络。