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幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）是广泛感染于人群胃、十二指肠的革兰染色阴性的微需氧菌，已确认是慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因子，并被WHO列为人类第一类致癌原（Group I cancinogen），认为Hp的感染与胃癌和胃粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤发生有关。防治Hp感染是大幅度降低慢性胃病和胃癌发病的关键。许多抗生素虽能杀灭Hp，但所有治疗方案均存在疗程长、副作用大、费用昂贵、细菌易产生耐药性以及不宜在人群中大面积推广使用等缺点。目前认为最有前景的防治措施是开发安全、有效的Hp疫苗。由于Hp培养条件极其苛刻，生长缓慢，极易污染，以人工培养的方法获得大量Hp培养物十分困难，在Hp培养物中提取纯化蛋白的量也微乎其微。因此，通过大肠杆菌等基因工程菌获得Hp重组蛋白是研制疫苗的最佳方法。据文献报道，Hp细胞毒素相关蛋白（CagA）等具有强免疫原性和免疫保护性，霍乱毒素B亚单位（CTB）具有良好的粘膜免疫性剂作用。为此，本实验室通过原位PCR的方法获取Hp CagA和CTB基因，构建了Hp CagA以及CTB的重组质粒，并进行了重组蛋白的表达，为Hp口服疫苗的研制奠定了基础。1.Hp CagA和CTB基因的获取 合成Hp NCTC11637 CagA和霍乱弧菌古典生物型CTB基因的全长引物，两端设计与载体匹配的酶切位点，分别经原位PCR，获取Hp CagA和CTB的全长基因片段。2.CagA-pGEMEX-1、CTB-pGEMEX-1重组质粒的构建 以Sac1、Xho1双酶切CagA全长片段，以Xho1和Apa1双酶切CTB；酶切产 20（）浙江大学硕士学位论文物与同样酶切的 PGEMEl用 T4 DNA连接酶作粘端连接，得到 CagA－PGEMEX－l、crsPcliulEix－互重组质粒。以盯 和酶切方法筛选鉴定重组质粒。后者经测序证实序列已完整无误的插入PGEMEX－l载体。3．CagA－pGEffeX－l、CTB－pGEMEX－二重组质粒在大肠杆菌N109DE3中的表达 CagArpGEMEX－l、CTB－pGEMEX－l重组质粒转化至JM109DE3菌株后，从基因和蛋白质水平对CagA－pGEMEX－l、L7B－pGEMEX－1进行检测。基因检测仍用原位PCR法，结果发现转化了 CagA－PGEMEX－豆 的菌株出现一条 3．8 Kb的阳性条带，转化了CTB－pGEMEX－l的菌株出现一条0．4 Kb左右的阳性条带。重组质粒转化菌株用IPTG诱导后，行全菌SDS－PAGE，结果出现预计的融合蛋白条带：转化了CagA－pGEMEX－1的菌株出现了150 kDa左右的蛋白条带，经Destern blot证实有Hp NCTCll637CagA的反应原性；转化了CTB－pGEMEX－1的菌株出现一条35 kDa左右的蛋白条带。 结论：1．成功构建了重组质粒CagA－PGEMEX－1、C’rB－PGEMEX刁，其中后者经序列分析证实对码、序列无误。2．SDS－PAGE证实经重组质粒CagA－…EMEX－l、L7B－灿EMEX－互转化的大肠杆菌川109DE3能够成功表达CasA、CTB融合蛋白。3．免疫印迹法证实重组质粒CagAngEMEX－1转化的大肠杆菌JM109DE3表达的融合CagA蛋白具有免疫反应性。