论文部分内容阅读
硫酸软骨素酶在研究硫酸软骨素类糖胺多糖的结构、性质与功能等方面有多种重要用途。近年来，该酶在临床领域的应用广泛，用来治疗某些疾病如大骨节病、椎间盘突出等。同时，该酶在制备低分子量硫酸软骨素方面也存在着广阔的应用前景。因此，获得酶活力高的硫酸软骨素酶具有重要的理论和现实意义。本研究从微生物中筛选出一株高产硫酸软骨素酶的菌株，并对菌株的发酵培养条件、酶的分离纯化及酶学性质等做了系统的研究。通过初筛和复筛从采集的样品中获得了一株高产硫酸软骨素酶菌株，编号为28，对其形态和生理生化特性进行了测定，初步鉴定该菌株为少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonaspaucimobilis）。该菌株所产的硫酸软骨素酶为胞外酶。为了提高产酶菌株的产酶能力，采用单次单因素实验方法对其进行了发酵产酶条件的优化。得到的最适发酵培养基组成为（%，w/v）：酵母粉1.0+硫酸软骨素0.5+NaCl0.5+KH2PO40.03+MgSO4·7H2O0.5，起始pH8.5；最适发酵培养条件为：摇瓶培养1.0%接种量、250mL摇瓶装量40mL、25℃、100r/min振荡培养36h，酶活力可达1.2U/mL。硫酸软骨素酶的分离纯化，采用了（NH4）2SO4沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析及SephadexG-100凝胶过滤层析等纯化步骤，结果获得了电泳纯的硫酸软骨素酶，酶纯化倍数为155.62，酶收率为46.87%，比活力为98.04U/mg。经SDS-PAGE电泳呈单条带，分子量约为82.3kDa。酶学性质的研究包括pH、温度、金属离子、底物浓度和底物专一性等。结果显示：该酶为诱导酶，在不添加硫酸软骨素的培养基中没有酶活性；该酶的最适反应pH值为6.5，最适反应温度为40℃；在实验所涉及的金属离子中，大部分金属离子对酶反应无影响；该酶对底物具有相对专一性，能降解硫酸软骨素、透明质酸和肝素等这一类结构相似的硫酸软骨素类糖胺聚糖，而对甲壳素和壳聚糖无降解作用。对该硫酸软骨素酶的酶解产物进行了质谱分析，结果显示该酶的降解产物几乎全为二糖，纯度较高，测得的降解产物的分子量约为458Da。