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研究背景肿瘤来源的外泌体能够通过促进肿瘤血管新生、诱导肿瘤相关成纤维细胞的分化、参与肿瘤微环境中的免疫调控促进肿瘤的免疫逃逸、塑造未来转移靶器官的微环境以实现自身转移等多种方式,调控肿瘤微环境,进而促进肿瘤的进展。肿瘤血管生成是肿瘤微环境一个重要的特征,在肿瘤的进展中发挥着关键作用。然而肿瘤在发展过程中在促进血管新生的同时,也同时伴随着原有及新生血管的破坏。外泌体如何破坏血管及其机制目前仍缺乏研究。实验目的本实验拟研究HeLa细胞来源的外泌体对血管内皮细胞高表达的紧密连接蛋白_带状闭合蛋白1(Zona Occludens-1,ZO-1)及封闭蛋白5(Claudin-5,CLDN-5)蛋白表达水平的影响,并探讨其背后的机制。实验方法使用超速离心法超离提纯HeLa细胞分泌的外泌体,并使用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid,BCA)定量Hela细胞外泌体。采用电镜、免疫印迹法(Western bloting,WB)及粒径分析检测外泌体的特性。分离培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),于体外扩增并传代培养至 3-6 代。HUVEC使用5 μg/ml,10μg/ml HeLa外泌体作用48小时后使用免疫印迹法及细胞免疫荧光染色检测检测细胞的ZO-1及CLDN5蛋白水平,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测 ZO-1 及 CLDN5 信使 RNA(messenger RNA,mRNA)水平,以及异硫氰荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的右旋糖酐跨单内皮细胞层通透实验检测内皮细胞层的体外通透性,使用PBS及正常人宫颈内膜上皮细胞(human cervical epithelial cell,HCEC)作为对照。外泌体中的微小RNA使用RNA测序技术测序,以及受体HUVEC进行转录组测序,测序结果使用WB及PCR技术验证。受体细胞同时使用透射电镜检测细胞内变化。Balb/c裸鼠尾静脉注射HeLa外泌体后尾静脉注射FITC标记右旋糖酐,活体状态下使用激光共聚焦检测裸鼠耳缘动静脉血管的FITC-右旋糖酐的血管外渗漏程度。随后处死裸鼠,收集其肺组织及肝脏组织,制作冰冻切片并于荧光显微镜下观察上述组织中的FITC-右旋糖酐渗漏情况。另外肺组织冰冻切片予CD31/CLDN5及CD31/ZO-1免疫荧光共染色,荧光显微镜下观察并摄片。此外Balb/c裸鼠尾静脉注射HeLa外泌体1周后第四对乳腺接种转染荧光素酶(Luciferase)的4T1细胞并持续注射外泌体至4周,使用动物活体成像观察4T1细胞的转移范围。四周后处死裸鼠,取肺组织使用含10%苦味酸的多聚甲醛固定,石蜡包埋切片并予苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色。于光学显微镜下观察并摄片。实验结果我们发现使用超离法提纯的HeLa细胞外泌体表达CD63,CD9,CD81及Alix,其粒径范围约在100 nm左右。电镜结果提示外泌体呈现典型的浅杯口状。使用PKH26染色后HUVEC细胞能在6小时左右内吞进入细胞。HUVEC细胞经HeLa外泌体作用24小时后即出现HUVEC内皮细胞层通透性增加。WB及细胞荧光免疫染色结果提示经HeLa外泌体处理后的HUVEC细胞其ZO-1及CLDN5的水平明显下降。但细胞内ZO-1及CLDN5的mRNA水平无明显变化。Balb/c裸鼠尾静脉注射HeLa外泌体后4周后激光共聚焦显微镜提示裸鼠耳缘静脉的FITC右旋糖酐大量渗出。且HeLa外泌体明显增加4T1细胞的肺部转移。外泌体进行微小RNA测序并筛选所有影响ZO-1及CLDN5水平的微小RNA,使用对应的抑制RNA序列(inhibitor)抑制外泌体中对应的微小RNA后并不能逆转HeLa外泌体对内皮细胞紧密连接蛋白的抑制作用。透射电镜检测经外泌体作用后的HUVEC内部发生的变化,提示HeLa外泌体使HUVEC发生明显自噬作用。但使用氯喹(chloroquine,CQ)或3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)抑制细胞的自噬仍无法逆转HeLa细胞外泌体对HUVEC紧密连接蛋白的抑制。受体HUVEC细胞经转录组测序提示内质网应激通路的基因表达明显增加。WB及PCR均验证该通路活化。使用小干扰 RNA(small interface RNA,siRNA)技术干扰 HUVEC 的 PERK 基因后,基本逆转了 HeLa外泌体导致的HUVEC紧密连接蛋白下调。实验结论HeLa细胞来源的外泌体能够引起血管内皮细胞紧密连接下调,增加血管的通透性并促进肿瘤发生转移。这种作用是通过HeLa外泌体引起血管内皮细胞发生内质网应激实现的。