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目的：1.分析2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)基因MTATP6、MTATP8的变异,以期从分子水平研究该基因片段变异与T2DM的相关性.2.分析MTATP6、MTATP8基因变异与T2DM慢性并发症之间的相关性,为T2DM及其并发症的遗传危险因素评估提供参考.
方法：1.根据1999年WHO糖尿病诊断标准,选取浙江籍汉族人群中确诊为T2DM的无血缘关系患者254名,同时收集具有母系遗传特征的糖尿病家系,对所有患者作常规生化指标检测并记录基本临床资料.165名年龄匹配的健康体检者作为正常对照,排除高血压、高脂血症、脑血管病、糖尿病及家族史、口服葡萄糖耐量异常者.2.提取所有受试者全血基因组DNA,采用PCR扩增MTATP6、MTATP8,直接测序后与剑桥参考序列(revised Cambridge Reference Sequence,rCRS)进行比对.根据测序峰图,对可能存在的异质性变异采用变性高效液相色谱(denaturinghigh performance liquid chromatography,DHPLC)技术证实.3.借助生物信息学软件Clustal X及蛋白相关数据库,从氨基酸变异情况、蛋白结构分析MTATP6、MTATP8变异,并结合统计学方法分析MTATP6、MTATP8变异与T2DM及其慢性并发症的相关性.
结果：1.在T2DM患者中发现65个MTATP6、MTATP8变异位点,其中包括2个异质性变异,未见缺失和插入.在健康对照组中发现43个变异位点.所有位点在两组间差异无显著性.2.MTATP6、MTATP8变异频率在两组间差异无显著性.但T2DM MTATP6变异率稍高于健康对照(P=0.057).3.T2DM组和健康对照组多重SNP比较差异无显著性.但在T2DM组中,同时携带A8701G、A8860G、A9180G变异的发生率比同时携带A8860G、A9180G变异的发生率高(P<0.05),健康对照组中两者差异无显著性.4.部分变异仅在T2DM中以低频率出现,并未见相关报道,包括A8459G、T8603C、C8609T、A8623G、T8632C、A8689G、T8825C、T8867C、A8890G、G8920A、G8998A、A9079G、A9115G和G9139A.多数发生在线粒体ATPase6保守结构域的跨膜螺旋处,且大多发生了氨基酸性质改变,其中部分位点在不同物种中高度保守.5.将T2DM患者分为肥胖组和非肥胖组,C8414T、C8794T在非肥胖组中发生率较肥胖组高(P<0.05),G8697A在肥胖组中的发生率较非肥胖组高(P<0.05).仅出现在T2DM中的变异位点多分布在非肥胖组,包括C8406T、A8459G、G8557A、A8563G、T8594C、T8618C、T8603C、C8609T、A8689G、T8825C、T8867C、G8998A、A9115G和G9139A.6.根据T2DM慢性并发症(高血压、视网膜病变、周围神经病变和肾病)发生情况,对有变异的204例患者分别进行分组和临床表现分析,发现病程、BMI、FPG、HbAlc和TC在不同的分组间差异有显著性.其他各项指标在分组中差异无显著性.7.分组分析结果显示,A8563G变异率分别在并发高血压、视网膜病变以及同时并发高血压和视网膜病变的患者中均高于未并发者(P<0.05).仅出现在T2DM中的变异大多仅分布于有高血压的患者中,包括:C8406T、A8459G、G8557A、A8563G、T8594C、C8609T、A8689G、A8890G、G8920A、G8998A、A9079G和G9139A.其他的临床慢性并发症分组中,无类似结果.
结论：
1.线粒体MTATP6、MTATP8基因存在大量变异,大部分可能为mtDNA的多态性位点,但不能排除部分位点提高个体对T2DM的易感性.
2.变异位点A8689G、G8920A、T8825C、G8998A、G9139A可能提高了T2DM易憾性.异质性位点T8867C、A8890G可能与T2DM存在一定关系.若患者携带这些位点,应采取早期预防措施,将疾病发生、发展的可能性降至最小.
3.携带MTATP6多重SNP:A8701G、A8860G、A9180G变异的个体对T2DM更易感.
4.A8563G与并发高血压、视网膜病变有关,携带该变异的患者应积极控制血糖,尽量减少并发症的发生.
5.变异位点C8406T、A8459G、G8557A、A8563G、T8594C、C8609T、A8689G、G8998A和G9139A可能与能量代谢失衡相关,其参与糖尿病、高血压等生物能学疾病的发生.