论文部分内容阅读
A组轮状病毒(Group A Rotavirus,简称ARV)是引起全世界5岁以下婴幼儿严重腹泻的首要病原,全世界每年有超过527,000个因感染轮状病毒而死亡的病例,且每年有近两百万以上儿童因此患重病。鉴于轮状病毒危害严重且无有效治疗手段,世界卫生组织一直将发展轮状病毒疫苗列为最优发展疫苗项目之一。接种RV疫苗被认为是减少重症RV感染、发病和死亡的最好方法,目前公认的最佳免疫方式为口服免疫。腺病毒载体是目前基因治疗和重组疫苗中应用最广泛的病毒载体之一。由于腺病毒能在呼吸道和肠道内繁殖,所以能诱导全身免疫并产生局部粘膜免疫。另外,腺病毒安全可靠,可以通过口服或滴鼻给药,不产生热源及其它副作用,适于婴幼儿使用。我们课题组前期以腺病毒为载体表达轮状病毒保护性抗原,对轮状病毒基因工程疫苗做了很多系统性的研究工作。我们研究表明,以Ad5为载体,表达轮状病毒VP6基因的重组腺病毒在滴鼻的免疫方式上,取得了比较好的免疫和保护效果。肠腺病毒HAdV-41是天然的人胃肠道病原,是潜在的口服给药基因转移载体和靶向治疗胃肠道载体,已有使用HAdV-41作为疫苗载体的相关报道。我们课题组前期已经成功构建了新型的E1区缺失的重组Ad41载体系统和能够促进HAdV-41在体外培养和扩增的细胞系293TE7,体外检测显示Ad41对酸的耐受情况好于Ad5。另外,口服给药是最简单的给药方式,与腹泻病毒天然的侵入方式相同,又有同时激活系统免疫和粘膜免疫的作用。因此,以Ad41为载体,探讨口服免疫重组轮状病毒疫苗的免疫保护作用具有重要的意义。基于前期的研究成果,在本研究中,我们利用反向遗传学的方法成功构建了HAdV-41感染性克隆pKAd41,建立了293TE7-HAdV-41系统,为进一步开展HAdV-41的生物学研究打下了基础,为促进Ad41作为口服疫苗载体的研究打下基础。本研究还成功制备了以Ad41为载体,稳定表达人轮状病毒VP6基因的非复制型重组腺病毒rvAd41-VP6(o),口服免疫小鼠结果证实,肠腺病毒载体Ad41作为疫苗载体,比Ad5更适合用于为腹泻病毒的疫苗研制,为Ad41作为口服疫苗载体的应用提供了有利证据。一、人腺病毒41型感染性克隆的成功构建目的：构建人腺病毒41型感染性克隆,以便进一步研究HAdV-41并改良Ad41载体系统。方法和结果：首先,我们用BglⅡ酶切携带GFP基因的重组腺病毒质粒pAd41-GFP,回收含有Kan-pBR322Ori和HAdV-41基因组左、右末端的片段,与野生型HAdV-41基因组DNA共电转化大肠杆菌BJ5183菌株发生同源重组,经Kan抗性筛选得到HAdV-41感染性克隆pKAd41,该克隆转染293TE7细胞成功拯救出野生型HAdV-41病毒；通过酶切和测序等方法鉴定拯救的HAdV-41病毒成功整合了稳定的基因组DNA；用Western blot技术验证了HAdV-41病毒含长短Fiber为41型腺病毒；银染实验从蛋白水平证实HAdV-41具有比较完整的病毒蛋白组分；分别用HAdV-41病毒感染293TE7和293细胞,免疫荧光技术检测发现Hexon蛋白在293TE7细胞中的表达更强；HAdV-41病毒在293TE7细胞中的生长曲线分析表明,HAdV-41病毒在293TE7细胞中具有非细胞溶解复制特性,并且只有非常少的子代病毒释放到培养上清中；我们分别以不同MOI的HAdV-41感染293TE7细胞,观察细胞在感染病毒后连续1～13d的变化,结果证实病毒感染细胞后在长时间的复制增殖过程中不会有噬斑的出现。结论：本部分研究成功构建了有效的感染性克隆pKAd41,表明用pKAd41和293TE7细胞系统来研究HAdV-41是可取的,为深入研究HAdV-41的生物学特性打下了基础,为第二部分利用Ad41作为口服疫苗基因转移载体的研究提供了有用信息。二、以Ad41为载体的轮状病毒VP6基因重组腺病毒免疫效果初探目的：以Ad41为载体,制备和鉴定可表达A组轮状病毒VP6基因的非复制型重组腺病毒,在小鼠模型上观察粘膜、体液和细胞免疫效果和攻毒保护作用,探讨肠腺病毒载体Ad41作为疫苗载体,用于腹泻病毒的疫苗研制的可行性。方法和结果：我们首先利用本室前期构建的重组腺病毒真核表达载体,PmeⅠ线性化后经脂质体介导转染293TE7细胞,包装出重组腺病毒rvAd41-VP6(o);经酶切和透射电子显微镜技术鉴定正确后,通过PCR、RT-PCR技术证实rvAd41-VP6(o)中确有特异性的VP6基因稳定整合并转录,有较好的遗传稳定性；通过Western blot技术鉴定目的蛋白的表达和病毒型特异性,结果证实rvAd41-VP6(o)为41型腺病毒,可稳定表达VP6蛋白；大量扩增rvAd41-VP6(o)并经氯化铯密度梯度离心纯化得到足量的重组腺病毒；用消化法和有限稀释法检测滴度,颗粒滴度和感染滴度分别达到了4.35×1011VP/ml和3.95×108IU/ml;一步法生长曲线实验证实了rvAd41-VP6(o)具备病毒复制生长的基本特征,病毒在细胞中具有非细胞溶解特性；我们在前期实验中体外检测证实了Ad41对酸的耐受情况好于Ad5；随后我们进行动物免疫实验,设rvAd41-VP6(o)、rvAd5-VP6(o)、 PBS三组分别以1×1010VP口服免疫小鼠,在同样的免疫剂量下,三次免疫后,ELISA检测显示rvAd41-VP6(o)组产生的血清IgG抗体从阳转比例(100%,10/10)到抗体强度(OD值1.0300±0.1984)均强于Ad5组(30%,3/10；0.3428±0.2760),引发了更强的体液免疫,攻毒后对小鼠的保护作用也优于Ad5。 rvAd41-VP6(o)组的小肠IgA抗体水平强于rvAd5-VP6(o),诱导了更强的粘膜免疫反应。但是,ELI Spot和CBA检测细胞免疫水平没有得到有统计学意义的结果。结论：我们成功制备了以Ad4I为载体的稳定表达VP6基因的重组腺病毒rvAd41-VP6(o),其在体外具有良好的生物学性质；动物免疫结果提示,肠腺病毒载体Ad41作为疫苗载体,比Ad5更适合用于腹泻病毒的疫苗研制。综上所述,本研究成功构建了人腺病毒HAdV-41感染性克隆pKAd41,建立了293TE7-HAdV-41系统,为进一步开展HAdV-41的生物学性状和功能研究打下了基础。本研究还以Ad41为载体,成功制备了稳定表达VP6基因的重组腺病毒rvAd41-VP6(o),证实了肠腺病毒载体Ad41是适宜的肠道给药的基因转移载体,Ad4l作为疫苗载体比Ad5更适合用于腹泻病毒的疫苗研制。