伊枯草菌素(Iturin A)是一种脂肽类抗生素，具有较强的抗真菌活性，已被广泛地应用于植物病原真菌的防治。在前期实验中，本实验室通过对野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZK0的复合诱变和选育，得到了一株高产IturinA的枯草芽孢杆菌（B.subtilis）ZK8，并建立了其发酵生产技术，实现了中试生产。但是，B.subtilis ZK8高产Iturin A的分子机制还不清楚。本论文主要从以下几个方面进行研究，探索B.subtilis ZK8高产Iturin A的分子机理:一、建立了适合B.subtilis ZK菌株的遗传电转化体系;二、克隆了B.subtilis ZK0菌株的Iturin A合成操纵子（ZK0-ituDABC），分析了该操纵子的启动子区、开放阅读框以及编码蛋白的保守结构域和基序等等，比较了B.subtilis ZK8菌株的IturinA合成操纵子(ZK8-ituDABC)与ZK0-ituDABC的序列差异。三、推测了枯草芽孢杆菌群体感应系统与ituDABC转录调控的关系，克隆了B.subtilis ZK8菌株群体感应系统的重要成员(degU、degS、comP、comA、comX、rapC、phrC)以及两个调控基因degQ和sigA，比较了这些基因在B.subtilis ZK0和ZK8菌株中的序列差异以及转录差异，研究了degU、degS、comP、comA、comX、rapC、phrC、degQ、sigA等基因的表达对iturinA产量的影响，初步了解了B.subtilisZK8高产iturin A的分子机制。四、通过基因敲除研究了群体感应系统的重要成员comX和phrC基因与Iturin A合成调控的关系。全文具体共分为4个章节。　　第一章:枯草芽孢杆菌(B.subtilis)ZK遗传电转化体系的建立　　电击转化是一种常用的遗传转化方法，广泛地应用于各种类型的细菌、真菌和细胞的转化操作。　　为了建立高效的、适合B.subtilis ZK菌株的遗传电转化体系，本章优化了7种实验因素（培养基、电场强度、生长时期、细胞壁弱化剂、电转化缓冲液、质粒用量和热激处理条件），确定了这些实验因素的最佳使用浓度和使用条件，比较了不同实验因素对电转化效率的影响，发现细胞壁弱化剂比其他6种实验因素更能明显地提高B.subtilis ZK菌株的电转化效率，实现了1×105cfu/μg DNA的电转化效率。为了快速地、最大限度地提高电转化效率，本章使用了响应面法来优化细胞壁弱化剂的复合使用浓度，快速地确定了复合使用细胞壁弱化剂（甘氨酸，苏氨酸和Tween80）的最佳浓度，大幅度地提升了B.subtilis ZK菌株的电转化效率（两个数量级），最终建立起了一个高效的（1×107cfu/μg DNA）电转化体系。该电转化效率与芽孢杆菌的最高电转化效率（1×1011cfu/μg DNA）相比仍然较低，这可能与B.subtilis ZK菌株的特异性有关，同时也说明了不同类型芽孢杆菌的电转化效率确实有着较大的差别。虽然该电转化效率与芽孢杆菌的最高电转化效率仍有较大差距，但是该电转化效率足够使一些重要的实验技术和手段应用于B.subtilis ZK菌株，例如基因敲除和文库的构建等等，为后续研究B.subtilis ZK8菌株高产Iturin A的分子机制奠定了基础。　　第二章:ZK0-ituDABC和ZK8-ituDABC的克隆、比较以及生物信息学分析　　本章参考了NCBI数据库中已报道的ituDABC核酸序列，设计了24对PCR引物，分段扩增了ZK0菌株的ituDABC操纵子，拼接得到一条完整的ituDABC序列，即ZK0-ituDABC。该操纵子全长38kbp，含有一个启动子区、四个开放阅读框(ituD，ituA，ituB，ituC)以及一个终止子区。同源序列比对的结果显示，总共19种ituDABC操纵子已经被分离和测序，这19种ituDABC操纵子来自于3种不同类型的细菌，分别是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和甲基营养型芽孢杆菌（B.methylotrophicus）。在19种已被测序的ituDABC操纵子中，与ZK0-ituDABC相似度最高的操纵子来自于解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens LFB112（相似度为99％），其与ZK0-ituDABC分在系统发育树的最近一支，说明这两个操纵子在进化上可能有着共同的起源，也说明B.subtilis ZK与B.amyloliquefaciens LFB112可能有着类似的遗传背景，提示在后续的研究中可以参考已公布的B.amyloliquefaciens LFB112基因组设计相关引物来分离B.subtilis ZK菌株的其他基因。　　本章还利用序列比对和文章检索等多种手段，在ZK0-ituDABC的启动子区的上游发现了一个类似于SigA因子识别区的DNA序列，一个类似于ComA因子识别区的DNA序列(TTTCGGTGAAACCCCAT)，识别了ZK0-ituDABC编码蛋白（伊枯草菌素合成酶）的十种保守结构域（分别为腺苷酰化结构域、缩合结构域、硫醇化结构域、异构化结构域、C末端硫酯结构域、酰基载体蛋白结构域、酮缩和酶结构域、酰基连接酶结构域、氨基转移酶结构域和丙二酰辅酶A转移酶结构域）及其核心基序，明确了这些保守结构域及其核心基序在合成酶上的具体位置和区域边界，总结了每种核心基序的共有序列。为后续比对ZK0-ituDABC和ZK8-ituDABC的DNA序列差异，分析ZK8-ituDABC的突变位点，研究ZK8菌株高产iturin A的分子机制奠定了基础。　　第三章:转录调控作用与枯草芽孢杆菌（B.subtilis）ZK8高产iturin A的联系　　本章检测了发酵过程中ituDABC的转录水平，比较了ituDABC在B.subtilisZK0菌株中和ZK8菌株中的转录差异，发现ZK8-ituDABC的转录水平明显比ZK0-ituDABC高（2～6倍），说明转录调控作用是B.subtilis ZK8菌株高产iturinA的重要原因。本章根据现有文献推测群体感应系统可能与ZK8菌株高产iturinA有着重要的联系，检测了群体感应系统的重要成员（degU/degS，comP/comA/comX，rapC/phrC）和两个转录调控因子基因degQ和sigA在发酵过程中的转录水平，比较了这些基因在B.subtilis ZK0和ZK8菌株中的转录差异，发现这些基因在B.subtilis ZK8菌株中的转录水平均比ZK0要高，提示这些基因可能参与了ituDABC的转录调控过程，可能是B.subtilis ZK8菌株高产iturinA的原因。为了进一步明确这些转录差异基因与B.subtilis ZK8高产iturinA的联系，将ZK8菌株的degU、degS、comP、comA、comX、rapC、phrC、degQ和sigA等基因分别转化至B.subtilis ZK0菌株并表达，并用HPLC和LC-MC等技术手段检测基因重组菌的发酵产物，发现comA和sigA基因的过表达会显著地提高iturin A的产量（25和35倍），而其他基因的过表达并没有明显地提高iturinA的产量，由此证实comA和sigA基因的确参与了ituDABC的转录调控过程，同时也说明comA和sigA基因的高表达是ZK8高产iturin A的一个重要原因。本研究发现群体感应系统的重要调控因子(ComA)和初级代谢调控因子(SigA)参与了ZK8-ituDABC的转录调控过程，为进一步分析B.subtilis ZK8高产iturin A的分子机制提供了重要的线索，也为进一步提高B.subtilis ZK菌株iturinA的产量提供了新的改良方法和途径。　　第四章:群体感应系统的重要成员（comX和phrC基因）的敲除　　信号肽ComX和PhrC是枯草芽孢杆菌群体感应系统的重要成员。主要负责感知周围环境并参与多个生命过程，比如对数生长期的转换、信息传递、参与芽孢和感受态的形成、激活下游调控基因、启动一些脂肽的分泌等等。而信号肽ComX和PhrC是否会参与ituDABC的转录调控过程尚无文献报道。　　第三章的研究发现了ComA蛋白因子可以调控iturinA的生物合成。ComA因子正是群体感应系统中ComX和PhrC信号传递途径上的重要成员，所以ituDABC可能会受到ComX和PhrC信号途径的调控。但是，第三章的研究还发现comX和phrC基因的过表达并没有明显提高iturinA的产量。为了进一步研究comX和phrC基因与ituDABC转录调控的关系，本章利用基因敲除技术敲除了B.subtilis ZK0的comX和phrC基因，构建了comX和phrC基因的基因突变株△phrC和△comX,检测了基因突变株发酵液中iturinA的含量，发现iturinA的浓度没有明显的变化，说明群体感应因子phrC和comX可能与iturinA的合成调控没有太大的联系，也不是B.subtilis ZK8菌株高产iturinA的原因。