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第一部分TREM2受体调控小胶质细胞增殖活化介导炎症反应目的探讨TREM2对LPS诱导的小胶质细胞增殖活化以及炎症反应的影响。方法提取新生SD大鼠大脑皮层小胶质细胞行原代培养,将细胞随机分为以下六组(n=3):对照(Control)组、LPS处理(LPS)组、阴性干扰(scramble+LPS)组、TREM2小干扰RNA(si RNA+LPS)组、空载质粒(Vector+LPS)组和TREM2pc DNA(pc DNA+LPS)组。LPS组、scramble+LPS组、si RNA+LPS组、Vector+LPS组和pc DNA+LPS组细胞予以LPS(100ng/m L)孵育24h;Control组不作任何处理。scramble+LPS组和si RNA+LPS组分别在LPS处理前48h予以阴性对照si RNA和TREM2 si RNA;Vector+LPS组和pc DNA+LPS组分别在LPS处理前48h予以空载质粒和TREM2 pc DNA。六组细胞LPS处理24h后,RT-PCR法测定各组细胞中TREM2、Iba-1、IL-6、TNF-α、IL-1β、i NOS、IL-4和IL-10的m RNA水平;CCK-8法测定细胞增殖率;流式细胞学方法测定细胞凋亡率;Western blot法测定cleaved caspase 3表达水平。结果1.与Control组比较,LPS组、scramble+LPS组、si RNA+LPS组、Vector+LPS组和pc DNA+LPS组细胞中TREM2 m RNA水平显著增加(P<0.05)。与LPS组比较,si RNA+LPS组细胞中TREM2 m RNA水平显著降低(P<0.05);pc DNA+LPS组细胞中TREM2 m RNA水平显著增加(P<0.05)。2.与Control组比较,LPS组、scramble+LPS组、si RNA+LPS组、Vector+LPS组和pc DNA+LPS组细胞的增殖率和Iba-1 m RNA水平显著增加(P<0.05)。与LPS组比较,si RNA+LPS组细胞的增殖率和Iba-1 m RNA水平显著降低(P<0.05);pc DNA+LPS组细胞的增殖率和Iba-1 m RNA水平显著增加(P<0.05)。3.与Control组比较,LPS组、scramble+LPS组、si RNA+LPS组、Vector+LPS组和pc DNA+LPS组细胞凋亡率和cleaved caspase 3蛋白水平明显增加(P<0.05)。与LPS组比较,si RNA+LPS组细胞凋亡率和cleaved caspase 3蛋白水平明显升高(P<0.05);pc DNA+LPS组小胶质细胞凋亡率和cleaved caspase 3蛋白水平明显降低(P<0.05)。4.与Control组比较,LPS组、scramble+LPS组、si RNA+LPS组、Vector+LPS组和pc DNA+LPS组细胞中促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β和i NOS m RNA水平显著增加(P<0.05),抑炎因子IL-4和IL-10 m RNA水平显著降低(P<0.05)。与LPS组比较,si RNA+LPS组细胞中促炎因子TNF-α、IL-1β和i NOS m RNA水平显著降低(P<0.05),抑炎因子IL-4和IL-10 m RNA水平显著增加(P<0.05);pc DNA+LPS组小胶质细胞中促炎因子TNF-α、IL-1β和i NOS m RNA水平显著增加(P<0.05),抑炎因子IL-4和IL-10m RNA水平显著降低(P<0.05)。结论小胶质细胞LPS处理24h后,TREM2表达增加,细胞增殖率和活化标记物Iba-1表达增加,促炎因子表达增高,抑炎因子水平降低。TREM2沉默可抑制LPS处理小胶质细胞的增殖和活化,抑制炎症反应;TREM2过表达可明显增加LPS处理小胶质细胞的增殖和活化,进一步促进炎症反应。第二部分TREM2受体调控小胶质细胞增殖活化介导神经病理性疼痛机制研究目的探讨TREM2调控脊髓小胶质细胞增殖活化,介导炎症反应,参与神经病理性疼痛的机制。方法清洁级2-3月龄SD大鼠60只,按随机数字表法分为两组(n=30):假手术(Sham)组和神经病理性疼痛(NP)组。NP组行CCI造模,Sham组仅暴露坐骨神经不结扎。两组大鼠于造模前1d和造模后1d、3d、7d、14d分别采用Western blot法和RT-PCR法测定L4-6脊髓中TREM2转录和表达水平。选取鞘内置管成功SD大鼠72只,按随机数字表法将大鼠随机分为六组(n=12):Sham组、NP组、TREM2抑制剂对照(NP+Ig G)组和TREM2抑制剂(NP+antagonist)组,TREM2激动剂对照(NP+saline)组和TREM2激动剂(NP+agonist)组。NP组、NP+Ig G组、NP+antagonist组、NP+saline组和NP+agonist组均行CCI造模;Sham组仅暴露坐骨神经不结扎。NP+antagonist组和NP+Ig G组大鼠于CCI造模前1d开始分别鞘内注射TREM2 antibody 0.3ug和Ig G 0.3ug(PBS稀释至10ul);NP+agonist组和NP+saline组均于相同时点分别鞘内注射Hsp60 5ug和saline 5ug;NP组和Sham组分别鞘内注射等量生理盐水,各组均连续给药8d。于造模前1d和造模后1d、3d、7d、14d测定六组大鼠机械痛阈和热痛阈;CCI造模后14d行为学测试结束后,Western blot法测定六组大鼠脊髓中Iba-1表达水平;RT-PCR法测定炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β、i NOS、IL-4和IL-10的m RNA水平;免疫荧光测定脊髓小胶质细胞数目。结果1.与CCI造模前1d比较,NP组大鼠脊髓中TREM2 m RNA和蛋白水平于造模后3d、7d和14d明显增加(P<0.05),造模后第3d表达最高;Sham组TREM2m RNA和蛋白水平造模后各时点无显著变化(P>0.05)。与Sham组比较,NP组大鼠脊髓中TREM2 m RNA和蛋白水平在CCI造模后3d、7d和14d明显增加(P<0.05)。2.与Sham组比较,NP组、NP+antagonist组、NP+Ig G组、NP+saline组MWT和TWL于造模后3d、7d、14d明显降低(P<0.05);NP+agonist组MWT和TWL于造模后1d、3d、7d、14d明显降低(P<0.05)。与NP组比较,NP+antagonist组MWT和TWL于造模后3d、7d、14d明显升高(P<0.05);NP+agonist组MWT和TWL于造模后1d、3d、7d、14d明显降低(P<0.05)。3.与Sham组比较,NP组、NP+antagonist组、NP+Ig G组、NP+saline组和NP+agonist组大鼠脊髓小胶质细胞数目和Iba-1蛋白水平明显增加(P<0.05)。与NP组比较,NP+antagonist组大鼠脊髓小胶质细胞数目和Iba-1蛋白水平明显减少(P<0.05);NP+agonist组大鼠脊髓小胶质细胞数目Iba-1蛋白水平明显增加(P<0.05)。4.与Sham组比较,NP组、NP+antagonist组、NP+Ig G组、NP+saline组和NP+agonist组大鼠脊髓小胶质细胞静息态标志物Tmem119和P2Ry12 m RNA水平明显降低(P<0.05);激活态标志物Cst 7和Spp1 m RNA水平明显增加(P<0.05)。与NP组比较,NP+antagonist组大鼠脊髓Tmem119和P2Ry12 m RNA水平显著增加(P<0.05),Cst 7和Spp1 m RNA水平明显降低(P<0.05);NP+agonist组大鼠脊髓中Tmem119和P2Ry12 m RNA水平显著降低(P<0.05),Cst 7和Spp1m RNA水平明显增加(P<0.05)。5.与Sham组比较,NP组、NP+antagonist组、NP+Ig G组、NP+saline组和NP+agonist组大鼠脊髓促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β和i NOS m RNA水平显著增加(P<0.05),抑炎因子IL-4和IL-10 m RNA水平显著降低(P<0.05)。与NP组比较,NP+antagonist大鼠脊髓促炎因子TNF-α、IL-1β和i NOS m RNA水平显著降低(P<0.05),抑炎因子IL-4和IL-10 m RNA水平显著增加(P<0.05);NP+agonist组大鼠脊髓促炎因子TNF-α、IL-1β和i NOS m RNA水平显著增加(P<0.05),抑炎因子IL-4和IL-10 m RNA水平显著降低(P<0.05)。结论CCI造模后大鼠脊髓中小胶质细胞数目和Iba-1表达增加,活化增强,促炎因子表达增加,抑炎因子水平减少,机械痛阈和热痛阈降低。TREM2抑制剂减少小胶质细胞增殖和活化,减轻炎症反应,缓解大鼠神经病理性疼痛。TREM2激动剂增强小胶质细胞增殖和活化,促进炎症反应,加剧神经病理性疼痛。