番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的代表成员,该病毒的寄主范围广泛,对农业生产危害严重。已经被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。TSWV目前尚无有效的防治措施,研究该病毒快速高效的检测方法,有助于早期发现病毒并及时采取措施进行防治,从而减轻该病毒所造成的经济损失。本实验利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术,建立了TSWV的快速定量定性检测方法。根据TSWV外壳蛋白N基因序列,设计了实时荧光定量PCR的特异性引物,获得了140bp大小的片段,并将小片段克隆到PEASYTM-T5载体上,经过菌落PCR筛选、酶切、测序等结果表明,PCR扩增获得片段与N基因部分片段同源性高,表明设计的引物特异性好；且该片段已经成功连接至载体,得到了重组质粒。以得到的重组质粒作为实时荧光定量PCR的标准品,对标准品进行一系列的梯度稀释,选择6个梯度稀释的标准品为模板进行SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR反应,得到的标准曲线回归方程为y=-3.538x+37.233,该扩增反应的效率为91.7%,相关系数为0.978,检测范围为9.84×101copies/μL～9.84×106copies/μL。熔解曲线只出现特异性的单个峰,而没有明显的引物二聚体或者非特异性扩增的峰出现,证明该方法具有良好的特异性。组间和组内的重复性实验的结果CV值均小于3%,农明该方法具有良好的重复性和稳定性。样品检测结果表明,荧光实时定量PCR方法与ELISA和常规RT-PCR分析结果一致,而荧光实时定量PCR方法可以定量病毒含量。