研究背景肺癌在全球范围内属于癌症死亡的主要原因,仅次于男性患前列腺癌和女性患乳腺癌的频率。随着近些年医疗和科研方面的进步,肺癌患者的预后仍然不乐观。所以对于肺癌的始动因素的研究是亟待解决的问题。众所周知,90%的肺部疾病的发生都源于长期吸烟,频繁摄取烟草会导致肺癌和慢性阻塞性肺病等病症。有吸烟史比无吸烟史的人患肺部疾病的风险高10倍左右。因此,预防肺部疾病的发生势在必行。目前至关紧要的是关注肺癌发生过程的治疗。其中,肺癌的发生是由烟草中众多的致癌物引起的,伴随有肿瘤的启动因子,共价致癌物,有毒物,炎性因子如充足的活性氧簇,苯并芘,煤焦油和许多其他类型的致癌物等。在提出预防癌症的策略过程中,靶向与单一药物显然不能完全缓解肺部疾病的发生,所以需要集中分析烟草混合物对机体的影响,这就意味着探讨烟草混合物对机体影响的分子机制对于肺癌的发生和预防起着举足轻重的作用。研究目的本课题拟检测烟草混合物对于肺正常细胞的多种生物学效应的影响情况,通过多种分子生物学实验技术探讨吸烟对正常肺细胞的DNA损伤及细胞周期关键蛋白的影响。本研究从这一方面出发,运用转录和翻译水平的调控方法研究烟草混合物影响机体异常的作用,并深入分析其分子机制。为肺癌的预后差,早期发现率低及其靶向治疗提供一定的研究线索。实验方法和结果1.通过细胞流式术检测烟草混合物呈不同浓度处理肺正常细胞后,细胞周期和细胞凋亡的变化情况。并结合蛋白质免疫印迹实验技术检测凋亡相关蛋白的表达,结果显示细胞在经过烟草处理之后,未能引起细胞凋亡,细胞周期也未发生阻滞,并具有统计学意义。2.利用免疫荧光,蛋白质免疫印迹等实验技术证明用烟草混合物处理肺正常细胞后,抑癌基因p53表达异常。3.分别通过转录水平和翻译水平检测抑癌基因p53的调控方式,并进一步证明其是受翻译水平调控而不是转录水平。主要通过荧光定量PCR实验证明p53基因转录水平的变化,并利用蛋白质免疫印迹技术检测p53蛋白水平的变化。4.利用不同基因型的MEF(Mouse Embryonic Fibroblast)证明p53的异常调控是独立于常见的经典的Mdm2 E3 ligase对p53的调控的方式。结论1.CSE在短时间内呈剂量依赖性处理肺正常细胞之后之后不会导致细胞凋亡,且逃逸细胞周期检测位点。2.在产生DNA损伤且未发生细胞凋亡的过程中,细胞周期检测位点同时也是抑癌基因p53,其蛋白水平在烟草混合物处理之后蛋白表达下调。3.CSE引起抑癌基因p53蛋白水平的下调不是通过转录水平而是通过翻译水平或者翻译后修饰所调控的。4.从翻译水平探讨烟草混合物诱导p53蛋白水平下调的方式,证明其是独立于Mdm2E3连接酶所介导的经典过程。