论文部分内容阅读
目的：本实验以宫颈癌细胞株Hela细胞和维吾尔族宫颈癌患者中提取培养的原代宫颈癌细胞作为实验对象，研究异甘草素(ISL)抑制宫颈癌细胞增殖作用及促进细胞凋亡作用机制。 方法：1.体外培养宫颈癌Hela细胞和原代细胞，用倒置光学显微镜观察细胞的形态学变化；2.不同浓度ISL处理Hela细胞和原代细胞，采用MTT法检测I SL对细胞体外增殖的抑制作用；3.应用流式细胞仪技术检测ISL对Hela细胞和原代细胞凋亡和周期的影响；4.通过caspase-3、8、9活性试剂盒测定ISL对Hela细胞半胱天冬酶活性的影响；5.应用罗丹明123染色法检测Hela细胞线粒体跨膜电位的变化；6.采用RT-PCR检测ISL对BCL-2，P53，P21,HPV18-E6mRNA基因表达的影响。7.应用免疫印迹技术检测ISL对BCL-2，P53，P21蛋白的表达情况； 结果：1.MTT检测结果表明：不同浓度的ISL作用于Hela细胞和原代细胞24h，48h,72h具有体外增殖的抑制作用(P<0.01)；2.流式细胞仪检测： ISL诱导Hela细胞和原代细胞凋亡，与空白对照组相比有极显著性统计学意义(P<0.01)，且凋亡率呈浓度依赖性；随着ISL浓度的增加，Hela细胞和原代细胞的S期细胞增多，Go/Gl期细胞减少，细胞周期阻滞在S期；3.Caspase-3、8、9的活性测定表明：各个浓度的ISL作用于Hela细胞与阴性对照组相比，Caspase-3、8、9的活性明显增高，且随着ISL浓度的增加，药物促进细胞凋亡(F=57.787、F=55.148、F=49.610.148，P<0.01)；4.罗丹明123荧光染色检测结果:Hela细胞线粒体膜电位随着药物浓度上升反而下降(F=118.904，P<0.01)；5. RT-PCR结果：药物剂量越增高HPV18-E6、BCL-2基因表达越下降(F=245.905、F=95.718，P<0.01)，P53、p21mRNA基因表达越升高(F=28.158、F=24.374，P<0.01)。6.Western-blot法检测表明ISL促使BCL-2蛋白表达水平降调，P53、P21蛋白表达水平上调，与对照组有统计学意义(P<0.01)； 结论： 1.异甘草素对人宫颈癌Hela细胞和原代细胞的增殖有较强的抑制作用，且呈一定的剂量和时间依赖性。 2.异甘草素能使宫颈癌HeLa细胞和原代细胞诱导并促进凋亡，细胞凋亡率呈一定的剂量依赖性；且能使周期阻滞于S期。 3.异甘草素能激活宫颈癌HeLa细胞线粒体膜电位及半胱天冬酶凋亡途径。 4.异甘草素诱导Hela细胞的凋亡，其机制是通过下调HPV18-E6、BCL-2的表达和上调P21、P53基因的表达来实现的。