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目的:砷是一类广泛存在于环境中的有毒类金属,存在于泥土、食物和地下水中。砷通过不同的机制发挥毒性作用,已被确定为一种致癌毒物。在中枢神经系统中,砷暴露可诱发认知功能障碍,影响神经发育,它与包括神经发育改变在内的一些神经疾病有关,被认为是神经退行性疾病的危险因素。然而,神经细胞死亡是目前研究较为广泛的机制之一。细胞死亡种类包括细胞凋亡、细胞自噬、细胞焦亡等,但对一种新型细胞死亡方式程序性坏死的研究较少。miR-21作为一个研究较为广泛的miRNA,通过对靶基因的调控影响着生物体的生命进程。在砷的作用下JNK/STAT3信号通路激活,并伴随着miR-21水平的升高。miR-21通过对靶基因BCL2和PTEN的调控,进而影响线粒体自噬相关分子MFN2、BNIP3、BECLIN1、PINK1以及PARKIN的蛋白水平,即导致线粒体自噬水平发生改变。进一步,线粒体自噬的发生可以促进程序性坏死。为了探讨砷的神经毒性的具体机制,首先建立小鼠和HT-22细胞砷暴露模型观察和研究砷对小鼠学习记忆能力的影响以及砷对线粒体自噬和程序性坏死水平的影响。采用miR-21干预模型探讨和研究miR-21与小鼠学习记忆能力的关系以及miR-21对线粒体自噬和程序性坏死水平的影响。此外,为了探讨线粒体自噬和程序性坏死之间的关系,使用线粒体自噬抑制剂（Mdivi-1）对HT-22细胞进行处理,旨在验证在砷作用下,线粒体自噬促进程序性坏死的发生。希望为砷诱导的神经损伤的机制研究提供新的依据。研究方法:在体内实验中,采用初断乳的昆明小鼠,建立砷暴露模型和AAV miR-21干预（抑制miR-21）模型,砷暴露模型共计4组,分为Na As O2 0 mg/L、Na As O2 20mg/L、Na As O2 40 mg/L和Na As O2 80 mg/L组,AAV miR-21干预模型共计4组,分别为CON、AAV miR-21、Na As O2以及Na As O2+AAV miR-21组,每组15只,染毒时间为90天。在体外实验中,采用HT-22细胞建立砷暴露模型和miR-21干预模型（mimic和Inhibitor）。砷暴露模型分为0μM、7.5μM、15μM、30μM四个浓度组。miR-21干预模型（1）Mimic干预分为四组,分别是CON、mimic miR-21、Na As02、Na As O2+mimic miR-21,染砷浓度为30μM。（2）Inhibitor干预分为四组,分别是CON、inhibitor miR-21、Na As02、Na As O2+inhibitor miR-21,染砷浓度为30μM。此外,采用HT-22细胞建立Nec-1干预模型、Midiv-1干预模型和SP600125干预模型,（1）Nec-1干预模型分为四组,分别是CON、Nec-1、Na As02、Na As O2+Nec-1组,Nec-1干预浓度为20μM,染砷浓度为30μM。（2）Midiv-1干预模型分为四组,包括CON、Midiv-1、Na As02、Na As O2+Midiv-1组,Midiv-1干预浓度为20μM,染砷浓度为30μM。（3）SP600125干预模型,包括CON、SP600125、Na As02、Na As O2+SP600125组,SP600125干预浓度为10μM,染砷浓度为30μM。Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力;HE染色和尼氏染色法检测小鼠海马组织中神经元细胞情况;Western Blot法检测p-JNK、STAT3、p-STAT3、BCL2、PTEN、BECLIN1、PINK1、PARKIN、MFN2、BNIP3、自噬相关蛋白LC3、P62、ATG5以及程序性坏死相关指标RIPK1、RIPK3、p-MLKL的水平;PCR法检测miR-21水平;免疫荧光方法检测程序性坏死关键性指标p-MLKL的水平;使用CCK-8试剂盒检测HT-22细胞存活率;使用LDH试剂盒检测HT-22细胞乳酸脱氢酶的释放率。结果:1、亚砷酸钠暴露影响小鼠的学习记忆能力。在染毒期间,各组小鼠体重正常增加,且各组间饮水量无统计学差异。Morris水迷宫定位航行实验结果显示,与0mg/L组相比,80mg/L亚砷酸钠暴露组小鼠的逃避潜伏期从训练第二天开始明显延长（p＜0.05）,但各组小鼠的游泳速度差异无统计学意义。在空间探索实验中,与0mg/L组相比,40 mg/L和80 mg/L亚砷酸钠暴露组小鼠首次到达目标区域的时间明显延长,穿越平台次数显著降低,且在目标象限中停留的时间显著降低（p＜0.05）。小鼠游泳路径结果显示,40 mg/L和80 mg/L亚砷酸钠暴露组小鼠有发现平台障碍。以上结果提示,亚砷酸钠暴露影响小鼠的学习记忆能力。2、亚砷酸钠激活JNK/STAT3信号通路且上调miR-21水平Western Blot结果提示,亚砷酸钠暴露组p-JNK和p-STAT3的蛋白表达量显著高于对照组（p＜0.05）,且PCR实验结果显示亚砷酸钠暴露上调miR-21的水平,体外实验与体内实验结果一致。3、亚砷酸钠暴露降低miR-21的靶基因PTEN和BCL2的蛋白水平亚砷酸钠作用下PTEN和BCL2的表达量由Western Blot方法检测,结果表明,亚砷酸钠暴露组小鼠海马组织中PTEN和BCL2的蛋白表达水平显著低于对照组（p＜0.05）,体外实验与体内实验结果一致。以上结果提示亚砷酸钠暴露降低PTEN和BCL2的蛋白水平。4、亚砷酸钠暴露促进线粒体自噬在小鼠砷暴露模型中,与对照组相比,亚砷酸钠暴露增加BECLIN1、PINK1、PARKIN、MFN2、BNIP3、LC3和ATG5蛋白表达,而降低P62蛋白水平。体外实验与体内实验结果相一致。以上结果均提示亚砷酸钠暴露上调线粒体自噬的水平。5、亚砷酸钠诱导小鼠海马神经元细胞程序性坏死在体内实验中,HE染色结果显示,与对照组相比,亚砷酸钠暴露组小鼠海马组织细胞有不同程度的核固缩和深染,提示细胞死亡。尼氏染色结果显示,小鼠海马组织神经元细胞有丢失。Western Blot结果显示随着染砷浓度的增加,程序性坏死指标RIPK1、RIPK3和p-MLKL蛋白水平增加,p-MLKL的荧光强度增强,特别是80mg/L组。在体外实验中,CCK-8试剂盒检测HT-22细胞活力,结果发现细胞活力随着砷浓度的增加而降低。同时,采用LDH试剂盒检测HT-22细胞的乳酸脱氢酶释放率,结果显示,随着染砷浓度的增加,乳酸脱氢酶的释放率上升（p＜0.05）。采用Western Blot实验技术和免疫荧光技术对程序性坏死的指标进行测定,结果发现,体外实验结果与体内实验结果一致。CCK-8试剂盒检测Nec-1干预后HT-22细胞的存活率,结果发现,与Na As O2组相比,Na As O2+Nec-1组细胞活力明显升高（p＜0.05）。采用LDH试剂盒检测Nec-1干预后HT-22细胞的乳酸脱氢酶释放率,与Na As O2组相比,Na As O2+Nec-1组细胞乳酸脱氢酶释放率明显降低（p＜0.05）。Nec-1干预后HT-22细胞p-MLKL的荧光强度显著低于未干预组。以上结果均提示亚砷酸钠诱导神经元细胞死亡有程序性坏死的参与。6、JNK/STAT3信号通路介导miR-21上调JNK通路抑制剂SP600125干预HT-22后,Western Blot结果显示SP600125可有效抑制p-JNK、p-STAT3的蛋白表达,且降低miR-21的水平（p＜0.05）。以上结果提示JNK/STAT3信号通路参与亚砷酸钠上调miR-21水平。7、miR-21参与亚砷酸钠降低小鼠学习记忆能力小鼠AAV干预后,小鼠海马组织中显示GFP绿色荧光,提示AAV感染成功。PCR检测小鼠海马组织中miR-21的水平,与Na As O2组相比,Na As O2+AAV miR-21组miR-21水平显著下降（p＜0.05）,提示AAV miR-21可有效抑制miR-21水平。小鼠在饲养期间体重正常增加,各组间无统计学差异,且饮水量差异无统计学意义。Morris水迷宫结果显示,在定位航行实验中,与Na As O2组相比,Na As O2+AAV miR-21组小鼠的逃避潜伏期明显缩短（p＜0.05）,各组小鼠的游泳速度间无显著性差异。在空间探索实验中,与Na As O2组相比较,Na As O2+AAV miR-21组小鼠首次到达目标区域的时间明显缩短（p＜0.05）,但小鼠穿越平台的次数以及在目标象限中花费的时间各组间差异无统计学意义。小鼠游泳路径结果显示,与Na As O2组相比,Na As O2+AAV miR-21组小鼠发现平台障碍情况有所改善。这些发现表明,AAV miR-21有效的保护了砷暴露导致的小鼠神经损伤。证明miR-21在神经损伤中的重要作用。8、亚砷酸钠通过miR-21调控BCL2和PTEN的表达小鼠AAV干预后,Western Blot检测PTEN、BCL2的表达情况,结果显示,与Na As O2组相比,Na As O2+AAV miR-21组小鼠海马组织中PTEN、BCL2的蛋白表达量显著升高（p＜0.05）,体外实验Inhibitor干预与体内实验结果一致。体外实验Mimic干预后HT-22细胞中Na As O2组、Na As O2+mimic miR-21组和mimic miR-21组PTEN、BCL2的蛋白表达量显著低于对照组（p＜0.05）。以上结果提示亚砷酸钠通过miR-21下调PTEN、BCL2的蛋白水平。9、miR-21/BCL2和miR-21/PTEN参与亚砷酸钠诱导神经元细胞线粒体自噬Western Blot结果显示,与各自的Na As O2组相比较,Na As O2+AAV miR-21组和Na As O2+Inhibitor miR-21组BECLIN1、PINK1、PARKIN和MFN2、BNIP3以及LC3和ATG5的蛋白表达量显著下降,而P62蛋白表达量上升（p＜0.05）。Mimic干预后,与CON组相比较,Na As O2组、Na As O2+mimic miR-21组和mimic miR-21组BECLIN1和PINK1、PARKIN、MFN2和BNIP3以及LC3和ATG5蛋白表达量均显著增高,P62蛋白水平降低（p＜0.05）。提示miR-21促进线粒体自噬的发生。10、miR-21参与亚砷酸钠诱导神经元细胞程序性坏死小鼠AAV干预后,HE染色结果显示,Na As O2+AAV miR-21组小鼠的海马神经元细胞中的核固缩和核深染的数量低于Na As O2组,提示Na As O2+AAV miR-21组细胞死亡少于Na As O2组。尼氏染色结果提示,与Na As O2组相比,Na As O2+AAV miR-21中尼氏小体的数量增多,表明神经元细胞丧失减少。Western Blot结果显示,Na As O2组RIPK1、RIPK3和p-MLKL的蛋白表达量均高于CON,且Na As O2+AAV miR-21组均低于Na As O2组（p＜0.05）。免疫荧光结果显示Na As O2+AAV miR-21组小鼠海马组织p-MLKL的荧光强度低于Na As O2组。以上结果提示miR-21的干预降低了程序性坏死的水平。体外实验中,在mimic miR-21干预后,Na As O2组、mimic miR-21组和Na As O2+mimic miR-21组的细胞活力显著低于CON组。Na As O2组、mimic miR-21组和Na As O2+mimic miR-21组的乳酸脱氢酶释放率显著高于CON组（p＜0.05）。Western Blot结果显示,Na As O2+mimic miR-21组、Na As O2组和mimic miR-21组RIPK1、RIPK3、p-MLKL的水平显著高于CON组（p＜0.05）。p-MLKL免疫荧光结果显示Na As O2组、mimic miR-21组和Na As O2+mimic miR-21组的荧光强度高于CON组。在inhibitor miR-21干预后,Na As O2组的细胞活力显著低于CON组,且Na As O2+inhibitor miR-21组明显高于Na As O2组,Na As O2组的乳酸脱氢酶释放率显著高于CON组,且Na As O2+inhibitor miR-21组明显低于Na As O2组（p＜0.05）。Na As O2组的RIPK1、RIPK3、p-MLKL的蛋白水平显著高于CON组,且Na As O2+inhibitor miR-21组明显低于Na As O2组（p＜0.05）。Na As O2组的p-MLKL的荧光强度显著高于CON组,且Na As O2+inhibitor miR-21组明显低于Na As O2组。以上结果进一步证明miR-21在程序性坏死中发挥作用。11、亚砷酸钠诱导的线粒体自噬促进程序性坏死发生在Mdivi-1干预HT-22细胞后,CCK-8实验结果发现Na As O2组细胞活力明显低于CON组,且Na As O2+Mdivi-1组细胞活力显著高于Na As O2组（p＜0.05）。LDH试剂盒检测结果显示,Na As O2组乳酸脱氢酶释放率明显高于CON组,且Na As O2+Mdivi-1组低于Na As O2组（p＜0.05）。Western Blot结果显示,Na As O2+Mdivi-1组RIPK1、RIPK3、p-MLKL的表达量显著低于Na As O2组（p＜0.05）,Na As O2+Mdivi-1组的p-MLKL的荧光强度低于Na As O2组。以上结果说明砷作用下的线粒体自噬可促进程序性坏死的发生。结论:1、miR-21参与亚砷酸钠诱导的小鼠学习记忆能力下降。2、miR-21参与亚砷酸钠诱导的神经元细胞线粒体自噬和程序性坏死发生。3、亚砷酸钠通过JNK/STAT3信号通路上调miR-21水平。4、在亚砷酸钠的作用下线粒体自噬促进程序性坏死发生。