【摘 要】
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积雪草是一种药食两用的草药,其主要三萜成份为积雪草苷（Asiaticoside,AS）和羟基积雪草苷（Aadecassoside,MA）。据报道该成份对神经保护有积极作用,目前积雪草相关研究绝大部分为这两种皂苷。因此,在这项研究中,我们将从积雪草中分离出新的三萜化合物并验证其神经保护作用。（1）将干燥的积雪草粉碎,通过萃取,浓缩,采用甲醇-二氯甲烷硅胶柱梯度层析,通过薄层色谱合并得到若干组分,浓缩
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积雪草是一种药食两用的草药,其主要三萜成份为积雪草苷（Asiaticoside,AS）和羟基积雪草苷（Aadecassoside,MA）。据报道该成份对神经保护有积极作用,目前积雪草相关研究绝大部分为这两种皂苷。因此,在这项研究中,我们将从积雪草中分离出新的三萜化合物并验证其神经保护作用。（1）将干燥的积雪草粉碎,通过萃取,浓缩,采用甲醇-二氯甲烷硅胶柱梯度层析,通过薄层色谱合并得到若干组分,浓缩干燥,制备得到若干化合物。本文针对CA-1进行研究,应用高分辨质谱分析其化学结构。并用LPS诱导BV2细胞神经炎症模型,通过测定其释放的NO含量评估CA-1的抗炎作用。结果显示,相对于对照组,100μM的CA-1处理能够减少16μM NO的释放量,表明CA-1具有显著的抗神经炎症作用。（2）以高分化的PC12细胞为研究对象,采用6-OHDA诱导建立体外帕金森病模型,研究CA-1的体外抗帕金森作用。MTT法检测CA-1对PC12细胞的毒性以及CA-1、AS、MA的神经保护作用,进一步通过DCFH-DA探针检测细胞内活性氧（Reactive Oxygen,ROS）水平、半定量和实荧光时定量聚合酶链式反应、蛋白印迹（Western Blot,WB）等技术检测PC12细胞中相关基因和蛋白表达。结果表明CA-1在该模型中神经保护作用强于AS和MA。与模型组相比,CA-1剂量依赖性地提高了6-OHDA诱导PC12细胞的存活率,降低了细胞内ROS的水平,上调了Sod1、Cat、Bcl2基因表达。WB显示,CA-1上调了p38/ERK/JNK和PI3K/PDK1/Akt通路的蛋白表达,揭示其内在机制涉及这两个信号通路。确定CA-1具有抗帕金森病作用。（3）从THP-1细胞的c DNA中扩增出NLRP3基因,构建p ET29a-NLRP3质粒,于大肠杆菌BL21菌株中诱导表达NLRP3蛋白,并采用His标签-镍柱蛋白纯化体系纯化NLRP3蛋白;使用分子对接软件Autodock vina 1.1.2将NLRP3蛋白与化合物CA-1进行分子对接,预测其分子对接位点对其与蛋白亲和力进行打分。结果表明:NLRP3能够在大肠杆菌BL21菌株中表达,能通过His标签-镍柱体系纯化得到,但难以得到大量的可溶性的NLRP3蛋白;分子对接结果显示,CA-1与蛋白亲和力为-7.8 kcal mol-1(阳性对照化合物为-7.9 kcal mol-1)表明CA-1可以对接到靶点的活性口袋化合物。以上结果表明本研究分离的化合物CA-1具有神经保护作用,具有后续开发的潜质。
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