植物生存需要众多营养元素,包括Cu、Zn、Mo、H、Mn等一些金属离子。但过量离子对植物造成毒害。植物主要依靠“阳离子/H+”转换器排出体内多余离子,维持细胞离子恒稳态。H+-ATP水解酶水解提供能量驱动“阳离子/H+”转换器,因而H+-ATP酶活性对维持植株细胞内离子平衡具有重要意义。植物激素生长素(Auxin)和乙烯(Ethylene)参与响应多种逆境环境。外源离子能够影响二者之间的相互作用,但其机制尚需很多工作。本文利用对乙烯不敏感的生长素运输因子突变体、对NaCl敏感的乙烯合成因子突变体及它们的双突变体为材料,通过RT-PCR、遗传杂交、转基因、酵母双杂交、BIFC等研究技术,初步研究了过量阳离子对生长素和乙烯相互关系的影响机制。本实验从拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC)购买有关生长素运输因子的T-DNA插入突变体株系,鉴定后得到纯合体植株Atane (Arabidopsis thaliana Auxin transport mutant not sensitive to ethylene);同时购买了乙烯合成相关因子的T-DNA插入突变体株系进行纯合体鉴定,鉴定后得到纯合体植株Atern (Arabidopsis thaliana gene for Ethylene response to NaCl);利用遗传学杂交技术,得到双突变植株Atane/Atern。加拿大拟南芥资源网站(http://www.bar.utoronto.ca)基因芯片结果显示,NaCl处理显著改变AtANE和AtERN表达量。与此结果一致的RT-PCR结果显示：150 mM NaCl处理后AtANE表达量下降,而AtERN表达量则有所上升,表明NaCl在转录水平上诱导AtERN表达量升高、AtANE表达量降低；在65 mM CaCl2处理下, AtANE和AtERN表达量均有明显下降,表明NaCl和CaCl2在转录水平上调节AtANE和AtERN表达。构建AtANE::GUS和AtERN::GUS植株,染色实验发现AtANE和AtERN表达非常高,且从幼苗至成苗的各个部位都有明显表达。AtANE在未处理情况下几乎分布于整个植株,AtERN表达也非常明显。但在65 mM CaCl2处理下,染色AtANE和AtERN表达都明显下降；150 mM NaCl处理抑制AtANE表达,但增加AtERN表达。这些染色结果与RT-PCR结果一致。在150mM NaCl处理下,Atane和Atern萌发及根伸长受到明显抑制,证明Na+影响Atane和Atern植株幼苗的生长发育。65 mM CaCl2在一定程度上抑制了Atane和Atern萌发及植株幼苗萌发,但与野生型相比差异并不显著,说明了Ca2+对Atane和Atern植株幼苗萌发及根生长发育影响较小H+-ATPase酶活性对植物体维持胞内离子平衡很重要。测定其酶活性结果显示,分别使用150 mM NaCl和65 mM CaCl2处理时,该酶活性在Atane和Atern中都有明显的增加：150 mM NaCl处理时,Atane中H+-ATP酶活性增加22.9%,Atern中H+-ATP酶活性增加32.9%；65mM CaCl2处理时Atane中H+-ATP酶活性增加38.5%,Atern中H+-ATP酶活性增加116%。利用pH探针进一步测定植物体内H+浓度变化,结果显示：150 mM NaCl和65 mM CaCl2处理时Atane和Atern中H+浓度都有所升高。推测AtANE、AtERN通过提高H+-ATP酶活性来排除细胞内多余的离子,维持细胞内离子平衡,提高植株对阳离子的适应能力。为了探究AtANE和AtERN之间的相互关系,酵母双杂交实验结果显示PACT-AtERN/ PAS2-AtANE酵母菌落显示蓝色；双分子荧光互补实验结果在野生型拟南芥叶肉细胞原生质体内,能检测到发生相互作用的黄色荧光信号。这些结果说明AtANE和AtERN在蛋白水平上存在一定的相互作用。使用乙烯抑制剂AgNO3及生长素抑制剂NPA处理突变体,Ag+对Atane单突变体植株的萌发及根长抑制程度要明显高于其他3种植株。推测乙烯的正常合成影响AtANE表达。综上所述,AtANE和AtERN具有一定相互作用关系,且推测AtANE表达有赖于乙烯的正常合成。AtANE和AtERN参与了植株应对Na+、Ca2+的响应过程。Na+和Ca2+参与了AtANE和AtERN植株相互作用调节,并通过提高H+-ATP酶活性来排出细胞内多余的离子,维持植物体内离子稳态。