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植物病害严重降低作物产量，进而威胁粮食安全，因此培育抗病品种成为作物育种的重要目标之一。挖掘与病害免疫相关的小肽和蛋白对作物改良具有重要的理论意义和应用价值。小肽是一类由2～100个氨基酸组成的小分子物质，在生物体的多种生命活动中具有重要的功能，同时也具有很高的开发应用价值。以往的研究大多集中在来源于传统编码区的传统肽(CPs)，最新的研究表明来源于传统认为不翻译的区域的非传统肽(NCPs)在生物体的多种生命活动中也发挥着关键的作用，包括生长发育和免疫调控。而在植物领域，由于NCPs大规模提取及鉴定方法的缺乏，极大的限制了植物NCPs的研究，也严重约束了人们对植物NCPs的认知和利用。该研究围绕大规模挖掘植物NCPs的需求，首次建立了植物多肽基因组学的方法，并利用该方法在单子叶植物玉米和双子叶植物拟南芥中进行了NCPs的大规模挖掘。在建立的多肽基因组学方法的基础上，构建了比较多肽基因组学技术体系，在玉米中研究了受病原相关分子模式(PAMP)诱导的NCPs。进一步的功能研究首次证实了NCPs在调控玉米天然免疫反应及抗病中的积极作用。另外，采用比较蛋白质组学方法，挖掘了与P.polysora抗性相关的蛋白，并对其中一个候选蛋白(ZmREM1.3)进行了功能研究，证实了其在P.polysora抗性中的作用，并探讨了其作用机制。主要研究结果如下:
1、该研究首次建立了植物多肽基因组学的方法。该方法利用水浴加热结合添加植物蛋白酶抑制剂来避免内源肽提取过程中大分子蛋白和内源肽自身的降解，并利用10KDa超滤管对内源肽进行富集。对富集后的内源肽进行高通量的质谱检测，质谱结果分别搜索Ensembl蛋白数据库和自建的多肽基因组数据库。将得到的高可信度内源肽进行合并后匹配到对应的基因组位置，并去除多基因组匹配位点的内源肽。最后根据基因组注释将来源于传统编码区的内源肽定义为CPs，将来源于传统认为不翻译的区域（包括基因间区、UTRs区、内含子区和跨基因元件的区域）的内源肽定义为NCPs。
2、利用建立的植物多肽基因组学的方法，在玉米中鉴定到1993个NCPs和844个CPs。分析研究发现，NCPs的肽段长度显著短于CPs的肽段长度，NCPs的分子量也小于CPs的分子量，说明NCPs和CPs具有不同的分子特征。通过分析NCPs和CPs的基因组分布发现，NCPs呈现出和CPs不一样的分布特征，CPs在染色体上偏向于端粒分布，而NCPs在染色体上均匀分布。进一步分析NCPs的来源发现，NCPs的来源比较广泛，可以来源于基因间区、内含子区、UTRs区，甚至可以跨越不同的基因元件。该结果在蛋白翻译水平上用直接的证据揭示了植物基因组中有大量以前认为不翻译的区域其实是可以翻译的。
3、采用三种不同的实验手段对我们建立的植物多肽基因组学方法进行了验证。首先，利用合成实验的方法对实验质谱和合成肽质谱进行了比较，结果表明，实验质谱和对应的合成肽质谱高度一致。接下来，进行了包括mRNA、circRNA、lncRNA和small RNA在内的转录组学分析，结果表明，1806(90.62％)个NCPs有转录数据支持。最后，通过核糖体印记测序(ribo-seq)的结果进行验证，结果表明，732个NCPs可以被ribo-seq结果验证。这些结果证明了我们建立的植物多肽基因组学方法的可靠性。为了进一步研究所建立的植物多肽基因组学的适用性，进一步将建立的植物多肽基因组学方法成功应用到了双子叶模式植物拟南芥中，在拟南芥中鉴定到1860个NCPs和2363个CPs。分析研究发现，在拟南芥中鉴定到的NCPs的肽段长度也显著短于CPs的肽段长度，并且拟南芥中鉴定到的NCPs也可以来源于基因间区、内含子区、UTRs区，甚至可以跨越不同的基因元件。结果表明，在单子叶植物和双子叶植物中，以前认为不翻译区域的翻译是普遍存在的，尽管它们可能有不同的翻译模式。以上结果表明，该植物多肽基因组学方法可应用于双子叶植物拟南芥和单子叶植物玉米，证明了所建立的植物多肽基因组学方法的广泛适用性。
4、利用全基因组关联分析(GWAS)进一步分析研究发现，NCPs在控制玉米相关数量性状（籽粒性状和抗病性）的区域和驯化区间显著富集，暗示了NCPs在玉米进化和复杂数量性状（尤其是抗病性）中的重要作用。为了进一步研究玉米NCPs与抗病的关系，建立了比较多肽基因组学技术体系。采用植物天然免疫诱导物flg22(PAMP)处理玉米，研究了PAMP诱导后的玉米内源肽变化情况。共鉴定到662个差异表达的内源肽，其中CPs451个，NCPs211个。在处理后30分钟和24小时，分别鉴定到428个差异表达的内源肽，其中共有的差异表达内源肽有194个。在这些差异表达的内源肽中，6个NCPs在处理后30分钟和24小时均上调表达，7个NCPs均诱导表达。通过对玉米PAMP诱导的差异表达NCPs的鉴定，为NCPs在植物天然免疫反应中的功能研究奠定了基础。
5、为了进一步研究PAMP诱导的NCPs在玉米天然免疫反应以及玉米抗病中的作用，对13个诱导或上调表达的NCPs进行免疫相关参数检测，共筛选到2个NCPs在植物天然免疫反应中起着重要作用，其中1个NCP对玉米病害具有广谱抗性，我们命名为NCP-1。研究表明，NCP-1可以促进活性氧(ROS)的积累、胼胝质的沉积及防御相关基因的表达。最后，通过对玉米小斑病、根腐病和新月弯孢菌的抗性进行鉴定发现，NCP-1可以显著提高玉米对多种病害的抗性。上述结果表明，NCP-1可以作为植物免疫信号分子调控植物的天然免疫反应，进而诱导植物的抗病性。该研究是NCPs在植物天然免疫反应中的首次报道，为植物NCPs的功能研究和植物抗病研究提供了新的思路和候选分子。
6、为了筛选南方锈病抗性相关蛋白，对玉米感病自交系(Lx9801)和抗病自交系(P178)接种玉米南方锈病病原多堆柄锈菌（P.polysora）及对照缓冲液的叶片进行了比较蛋白质组学分析。采用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)的方法共鉴定到了6612个蛋白质。其中，1489个蛋白在抗病自交系中差异表达，1035个蛋白在感病自交系中差异表达。GO富集分析表明这些差异表达的蛋白质富集在多个生物学过程，抗病组主要富集在代谢过程、细胞代谢过程和刺激响应;感病组主要富集在代谢过程、细胞代谢过程、生物调节和刺激响应。KEGG富集分析表明，这些差异表达的蛋白质在抗病组主要富集在碳固定途径、核糖体代谢和光合作用;感病组主要富集在光合作用、代谢途径和碳固定途径。
7、从这些差异表达的蛋白中，筛选了到3个防御相关候选蛋白进行了后续研究，证实了一个候选蛋白(ZmREM1.3)在玉米南方锈病抗性中起到重要作用。qRT-PCR分析发现，ZmREM1.3的表达不仅受P.polysora的诱导，而且还受植物激素水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)的诱导。进而采用转基因技术将ZmREM1.3在玉米中过表达，qRT-PCR和western blot分析发现ZmREM1.3在转基因阳性株系中的表达量显著高于对应的阴性株系。对转基因材料接种P.polysora后发现，过表达ZmREM1.3的转基因阳性株系对P.polysora的抗性显著增强，通过Mu转座子插入突变体证实了ZmREM1.3在P.polysora抗性中的积极作用。进一步研究发现，P.polysora侵染后，过表达ZmREM1.3的阳性株系的SA和JA含量显著提高，同时，防御相关基因在过表达ZmREM1.3阳性株系中的表达水平也显著高于对应的阴性株系。以上结果表明，ZmREM1.3可能通过SA/JA介导的防御信号通路，诱导防御相关基因的表达来正向调控玉米对P.polysora的抗性。
综上所述，本研究建立了植物多肽基因组学的方法，为植物NCPs的挖掘提供了新的方法，为植物NCPs的研究提供了新的思路。对单子叶植物和双子叶植物进行大规模NCPs的鉴定表明，植物基因组中有很大一部分以前认为不翻译的区域其实是可以翻译的，这在功能基因组学研究中具有重要意义，并将为植物功能基因组学的研究提供新的着力点。通过对NCPs在玉米天然免疫反应中的功能研究，首次证实了NCPs在玉米天然免疫反应中的重要作用，为植物抗病研究及抗病育种提供了新的思路和方向。另外，通过蛋白质组学技术鉴定了与南方锈病抗性相关的蛋白——ZmREM1.3，并通过实验证实了其在P.polysora抗性中的积极作用以及潜在的作用机制。为玉米抗病育种提供了新的抗性资源。
1、该研究首次建立了植物多肽基因组学的方法。该方法利用水浴加热结合添加植物蛋白酶抑制剂来避免内源肽提取过程中大分子蛋白和内源肽自身的降解，并利用10KDa超滤管对内源肽进行富集。对富集后的内源肽进行高通量的质谱检测，质谱结果分别搜索Ensembl蛋白数据库和自建的多肽基因组数据库。将得到的高可信度内源肽进行合并后匹配到对应的基因组位置，并去除多基因组匹配位点的内源肽。最后根据基因组注释将来源于传统编码区的内源肽定义为CPs，将来源于传统认为不翻译的区域（包括基因间区、UTRs区、内含子区和跨基因元件的区域）的内源肽定义为NCPs。
2、利用建立的植物多肽基因组学的方法，在玉米中鉴定到1993个NCPs和844个CPs。分析研究发现，NCPs的肽段长度显著短于CPs的肽段长度，NCPs的分子量也小于CPs的分子量，说明NCPs和CPs具有不同的分子特征。通过分析NCPs和CPs的基因组分布发现，NCPs呈现出和CPs不一样的分布特征，CPs在染色体上偏向于端粒分布，而NCPs在染色体上均匀分布。进一步分析NCPs的来源发现，NCPs的来源比较广泛，可以来源于基因间区、内含子区、UTRs区，甚至可以跨越不同的基因元件。该结果在蛋白翻译水平上用直接的证据揭示了植物基因组中有大量以前认为不翻译的区域其实是可以翻译的。
3、采用三种不同的实验手段对我们建立的植物多肽基因组学方法进行了验证。首先，利用合成实验的方法对实验质谱和合成肽质谱进行了比较，结果表明，实验质谱和对应的合成肽质谱高度一致。接下来，进行了包括mRNA、circRNA、lncRNA和small RNA在内的转录组学分析，结果表明，1806(90.62％)个NCPs有转录数据支持。最后，通过核糖体印记测序(ribo-seq)的结果进行验证，结果表明，732个NCPs可以被ribo-seq结果验证。这些结果证明了我们建立的植物多肽基因组学方法的可靠性。为了进一步研究所建立的植物多肽基因组学的适用性，进一步将建立的植物多肽基因组学方法成功应用到了双子叶模式植物拟南芥中，在拟南芥中鉴定到1860个NCPs和2363个CPs。分析研究发现，在拟南芥中鉴定到的NCPs的肽段长度也显著短于CPs的肽段长度，并且拟南芥中鉴定到的NCPs也可以来源于基因间区、内含子区、UTRs区，甚至可以跨越不同的基因元件。结果表明，在单子叶植物和双子叶植物中，以前认为不翻译区域的翻译是普遍存在的，尽管它们可能有不同的翻译模式。以上结果表明，该植物多肽基因组学方法可应用于双子叶植物拟南芥和单子叶植物玉米，证明了所建立的植物多肽基因组学方法的广泛适用性。
4、利用全基因组关联分析(GWAS)进一步分析研究发现，NCPs在控制玉米相关数量性状（籽粒性状和抗病性）的区域和驯化区间显著富集，暗示了NCPs在玉米进化和复杂数量性状（尤其是抗病性）中的重要作用。为了进一步研究玉米NCPs与抗病的关系，建立了比较多肽基因组学技术体系。采用植物天然免疫诱导物flg22(PAMP)处理玉米，研究了PAMP诱导后的玉米内源肽变化情况。共鉴定到662个差异表达的内源肽，其中CPs451个，NCPs211个。在处理后30分钟和24小时，分别鉴定到428个差异表达的内源肽，其中共有的差异表达内源肽有194个。在这些差异表达的内源肽中，6个NCPs在处理后30分钟和24小时均上调表达，7个NCPs均诱导表达。通过对玉米PAMP诱导的差异表达NCPs的鉴定，为NCPs在植物天然免疫反应中的功能研究奠定了基础。
5、为了进一步研究PAMP诱导的NCPs在玉米天然免疫反应以及玉米抗病中的作用，对13个诱导或上调表达的NCPs进行免疫相关参数检测，共筛选到2个NCPs在植物天然免疫反应中起着重要作用，其中1个NCP对玉米病害具有广谱抗性，我们命名为NCP-1。研究表明，NCP-1可以促进活性氧(ROS)的积累、胼胝质的沉积及防御相关基因的表达。最后，通过对玉米小斑病、根腐病和新月弯孢菌的抗性进行鉴定发现，NCP-1可以显著提高玉米对多种病害的抗性。上述结果表明，NCP-1可以作为植物免疫信号分子调控植物的天然免疫反应，进而诱导植物的抗病性。该研究是NCPs在植物天然免疫反应中的首次报道，为植物NCPs的功能研究和植物抗病研究提供了新的思路和候选分子。
6、为了筛选南方锈病抗性相关蛋白，对玉米感病自交系(Lx9801)和抗病自交系(P178)接种玉米南方锈病病原多堆柄锈菌（P.polysora）及对照缓冲液的叶片进行了比较蛋白质组学分析。采用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)的方法共鉴定到了6612个蛋白质。其中，1489个蛋白在抗病自交系中差异表达，1035个蛋白在感病自交系中差异表达。GO富集分析表明这些差异表达的蛋白质富集在多个生物学过程，抗病组主要富集在代谢过程、细胞代谢过程和刺激响应;感病组主要富集在代谢过程、细胞代谢过程、生物调节和刺激响应。KEGG富集分析表明，这些差异表达的蛋白质在抗病组主要富集在碳固定途径、核糖体代谢和光合作用;感病组主要富集在光合作用、代谢途径和碳固定途径。
7、从这些差异表达的蛋白中，筛选了到3个防御相关候选蛋白进行了后续研究，证实了一个候选蛋白(ZmREM1.3)在玉米南方锈病抗性中起到重要作用。qRT-PCR分析发现，ZmREM1.3的表达不仅受P.polysora的诱导，而且还受植物激素水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)的诱导。进而采用转基因技术将ZmREM1.3在玉米中过表达，qRT-PCR和western blot分析发现ZmREM1.3在转基因阳性株系中的表达量显著高于对应的阴性株系。对转基因材料接种P.polysora后发现，过表达ZmREM1.3的转基因阳性株系对P.polysora的抗性显著增强，通过Mu转座子插入突变体证实了ZmREM1.3在P.polysora抗性中的积极作用。进一步研究发现，P.polysora侵染后，过表达ZmREM1.3的阳性株系的SA和JA含量显著提高，同时，防御相关基因在过表达ZmREM1.3阳性株系中的表达水平也显著高于对应的阴性株系。以上结果表明，ZmREM1.3可能通过SA/JA介导的防御信号通路，诱导防御相关基因的表达来正向调控玉米对P.polysora的抗性。
综上所述，本研究建立了植物多肽基因组学的方法，为植物NCPs的挖掘提供了新的方法，为植物NCPs的研究提供了新的思路。对单子叶植物和双子叶植物进行大规模NCPs的鉴定表明，植物基因组中有很大一部分以前认为不翻译的区域其实是可以翻译的，这在功能基因组学研究中具有重要意义，并将为植物功能基因组学的研究提供新的着力点。通过对NCPs在玉米天然免疫反应中的功能研究，首次证实了NCPs在玉米天然免疫反应中的重要作用，为植物抗病研究及抗病育种提供了新的思路和方向。另外，通过蛋白质组学技术鉴定了与南方锈病抗性相关的蛋白——ZmREM1.3，并通过实验证实了其在P.polysora抗性中的积极作用以及潜在的作用机制。为玉米抗病育种提供了新的抗性资源。