[研究背景与目的]癌症患者数量与日俱增,通过手术切除、放化疗、甚至分子靶向抑制剂等单纯的治疗都无法完全根治癌症,且医疗花费巨大。癌症等重大疾病的的预防一直是研究的重点。选择低毒、经济且可长期应用的天然化合物预防癌症的策略正逐步受到人们的重视。黑蒜是一种新型的大蒜加工食品,具有抗菌、抗肿瘤、抗炎等许多生物学活性。黑蒜中的Diallyl Disulfide (DADS)具有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤细胞转移的潜能。本研究在于考察DADS对于化学致癌物诱导的小鼠皮肤癌体内和体外模型的预防作用,并阐明其确切的作用机制。[研究内容与结果]本研究首先利用经典的DMBA/TPA两阶段致癌模型及TPA诱导的JB6 P+细胞克隆形成实验分别在体内外考察DADS的癌症预防作用。结果表明预先给予DADS在体内可以浓度依赖性地降低皮肤乳突状淋瘤的发生率、平均荷瘤数目、肿瘤的大小以及在体外同样可以浓度依赖性地减少TPA诱导的克隆形成数目。考虑到DADS具有较强的抗氧化活性,通过检测小鼠背部皮肤中活性氧簇(Reactive Oxygen Species, ROS)的水平,发现预先给予DADS可以清除TPA诱导的高水平ROS含量,这主要与抗氧化酶活力的升高有关。采用Real-time PCR检测,发现DADS在体内外模型中均可以浓度依赖性地提升抗氧化酶的mRNA水平。进一步通过免疫组化和WesternBlot研究发现DADS可以在体内外浓度依赖性地促进小鼠皮肤细胞中的Nrf2入核。以上结果初步表明DADS的癌症预防作用与诱导Nrf2入核相关。选用Nrf2-/-小鼠进行反向验证,结果表明DADS无法预防DMBA/TPA诱导的Nrf2-/-小鼠背部皮肤乳突状淋瘤的发生与生长以及无法减少DMBA/TPA诱导的小鼠背部皮肤增厚。由此证明了DADS是通过诱导Nrf2入核促进抗氧化酶表达增多发挥癌症预防作用。利用细胞在体外探究DADS促进Nrf2入核的具体机制,通过WesterBlot和免疫荧光实验初步发现DADS可以时间依赖性地上调Nrf2的核表达。其中,DADS作用4-8h时能显著增加Nrf2的核内表达。另外,通过给予p-Akt抑制剂MK2206反向验证,进一步排除了DADS是通过激活MAPKs和Akt信号通路后引起Nrf2入核的级联反应。进一步研究发现,DADS能够时间依赖地诱导Nrf2总蛋白表达水平升高,但不影响Nrf2的mRNA水平。选用蛋白酶抑制剂MG132与DADS合用,结果表明DADS与MG132协同抑制Nrf2降解。由此可知DADS是通过抑制Nrf2的降解,从而引起了Nrf2的胞内蓄积及后续的入核。为了探究DADS抑制Nrf2降解的机制,我们首先排除了DADS对Nrf2胞内抑制因子Keap1的影响。而DADS能够时间依赖地增加Nrf2的另一个结合蛋白p21的表达水平。而p21可以与Keap1竞争性结合Nrf2,减少其降解。通过免疫共沉淀检测发现DADS不仅能促进p21的表达,而且能够促进p21与Nrf2的结合,进而减少了Nrf2的降解。此外,我们选用HEK293T细胞转染p21 siRNA反向验证了p21在DADS调节Nrf2蛋白水平过程中的重要作用。[结论与意义]基于以上结果,我们发现DADS成分可以预防化学致癌物诱导的小鼠背部皮肤乳突状淋瘤的发生和生长。给予DADS能够促进p21与Nrf2结合增多,进而减少了Nrf2的降解,增加了Nrf2的核表达并启动下游转录,促进抗氧化酶的表达上调,从而减少了ROS对机体的损伤,最终发挥了癌症预防作用。该课题阐明了DADS具有很好的癌症预防潜能并明确了DADS发挥癌症预防作用的机制,为DADS进入临床研究及日常生活中的应用提供了一个有力的证据。