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siRNA是一种可以特异性抑制细胞内靶基因表达的生物大分子,是治疗与基因表达紊乱相关疾病的理想生物类药物。但siRNA需要低毒、高效的递送载体辅助才能发挥对细胞内靶基因表达的抑制作用。非病毒载体以其多样性、非免疫性等优点成为siRNA递送系统的研发重点,但其siRNA递送效率远低于病毒载体。除了系统给药的组织靶向递送障碍,细胞内低的递送效率是亟待解决的问题。本课题组前期研究证明聚乙二醇(PEG)和疏水修饰的聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEMA)具有潜在的应用前景,本论文进一步探讨降低这类载体的毒性、提高胞内递送效率的有效途径。
本文拟将生物可降解的聚碳酸酯引入载体结构,并首次合成了用于聚碳酸酯修饰的环状碳酸酯单体MTC-Br,并以mPEG为引发剂通过开环聚合(ROP)和原子转移自由基聚合(ATRP)合成了以mPEG为亲水段,以PC为主链、PDMAEMA为支链的梳状聚合物mPEG-b-PC-g-PDMAEMA(GMDM)。GMDM能够有效地负载并递送siRNA。遗憾的是,GMDM的基因递送效率和生物相容性都没有明显的提高。
接下来,探讨了降低PDMAEMA类载体细胞毒性和胞内递送效率的有效途径。采用羟基化修饰阳离子单元来降低聚阳离子的生物毒性并用可酸敏感水解的聚缩醛为疏水段促进siRNA内涵体逃逸效率。通过链转移自由基聚合(RAFT)和环氧-巯基反应合成了以mPEG为亲水段、以聚缩醛(PTTMA)为疏水段、以N,N-二甲氨基硫醇改性的甲基丙烯酸缩水甘油醚(PGMAN)为阳离子段的羟基化pH敏感阳离子聚合物mPEG-b-PTTMA-b-PGMAN(ETGN)。研究结果表明,伴生羟基能够有效地减弱阳离子聚合物ETGN对细胞膜的破坏作用,提升ETGN的细胞相容性。当N/P=50时,ETGN/siRNA复合物的生物活性依然可以达到90%。同时,ETGN可以高效地递送siRNA,当N/P=50(50nM siRNA)时,ETGN/siRNA的体外基因沉默效率可以达到95%。并且,ETGN/siRNA在皮下组织和肝脏中分别取得了80%和92%基因沉默效率。进一步研究表明,ETGN的pH敏感降解性能够有效地增强siRNA内涵体逃逸能力进而提升基因沉默效率。但存在的问题是提高了细胞相容性,却需要在高载体剂量(N/P=50)下才能获得高的基因沉默效率。
针对疏水内核pH敏感性促进siRNA内涵体逃逸,有必要进行深入探讨以获得更优化的载体结构。这一问题的研究需要弱化胞吞效率因素的干扰。为此,本文设计合成了系列三嵌段共聚物PCB-b-P(DMAEMA-co-DPA)-b-PG(GDDC),其中,DMAEMA(pKa=8.4)与DPA(pKa=6.0)共聚单元比例可以有效地调节疏水段的pH敏感性。同时,聚羧酸甜菜碱(PCB)上的羧基与阳离子段聚胍基(PG)的氢键配对作用抑制细胞对GDDC/siRNA复合物的胞吞。细胞胞吞结果证明GDDC/siRNA系列复合物的细胞胞吞率相近,约为商用试剂Lipo2000/siRNA的1/6。以GDDC系列纳米粒的解组装pH值作为载体pH敏感性的参数,对比研究GDDC/siRNA系列复合物的细胞内基因沉默效率和内涵体逃逸能力。结果表明,解离pH(pHd)为~6.8的纳米粒GDDC-4表现出最高的siRNA内涵体逃逸效率和基因沉默效率,当N/P=8(50nM siRNA)时,基因沉默效率几乎达到~100%,明显高于Lipo2000(65%)。而且,体内皮下注射后,GDDC-4能够将siRNA长时间抑留在皮下组织中,并取得80%的基因沉默效率。
基于上述研究获得的最佳pH敏感内核结构,进一步探讨作用机理。质子缓冲能力被认为是阳离子聚合物促进内涵体逃逸的作用机理,但仍存争议。为避免阳离子段PG、PCB质子缓冲作用的干扰,采用季铵化的PDMAEMA(PTDMAEMA)为阳离子段,PEG为亲水链,制备了系列三嵌段阳离子聚合物mPEG-b-P(DMAEMA-co-DPA)-b-PTDMAEMA(TDDE),TDDE系列载体的胞吞量差别可以忽略不计。研究了TDDE的质子缓冲能力与内涵体逃逸能力的关系,发现在早期内涵体中质子缓冲能力较强的聚合物能更好地促进siRNA内涵体逃逸。进一步地,早期内涵体的pH变化差值占聚合物质子缓冲域的比例越大,即K值越大,其siRNA内涵体逃逸效率越高。由此,筛选出聚合物TDDE-3,表现出最高的siRNA逃逸效率以及对包括心肌细胞H9C2在内的多种细胞均有较高的基因沉默效率。此外,季铵化的PDMAEMA,使TDDE系列载体的毒性明显下降,是降低PDMAEMA类载体毒性的又一有效途径。
最后,基于上述GDDC-4和TDDE-3的结构与siRNA递送效率的关系,进一步探讨平衡细胞相容性和递送效率的途径。合成了P(DMAEMA-co-DPA)-b-PG(GDD-4)和mPEG-b-P(DMAEMA-co-DPA)-b-PG(GDDE-4)两种载体,对比研究GDDC-4、GDDE-4、GDD-4、TDDE-3的siRNA递送效率和生物相容性。四种载体中,GDDE-4具有最强的siRNA递送能力,当在N/P=8,5nM siRNA时,GDDE-4的基因沉默效率依然可以达到80%。TDDE-3的细胞毒性最低,但其siRNA的胞内递送效率也最低。另外,通过对比发现,PEG化修饰是改善阳离子聚合物siRNA递送效率的有效方式。
本文拟将生物可降解的聚碳酸酯引入载体结构,并首次合成了用于聚碳酸酯修饰的环状碳酸酯单体MTC-Br,并以mPEG为引发剂通过开环聚合(ROP)和原子转移自由基聚合(ATRP)合成了以mPEG为亲水段,以PC为主链、PDMAEMA为支链的梳状聚合物mPEG-b-PC-g-PDMAEMA(GMDM)。GMDM能够有效地负载并递送siRNA。遗憾的是,GMDM的基因递送效率和生物相容性都没有明显的提高。
接下来,探讨了降低PDMAEMA类载体细胞毒性和胞内递送效率的有效途径。采用羟基化修饰阳离子单元来降低聚阳离子的生物毒性并用可酸敏感水解的聚缩醛为疏水段促进siRNA内涵体逃逸效率。通过链转移自由基聚合(RAFT)和环氧-巯基反应合成了以mPEG为亲水段、以聚缩醛(PTTMA)为疏水段、以N,N-二甲氨基硫醇改性的甲基丙烯酸缩水甘油醚(PGMAN)为阳离子段的羟基化pH敏感阳离子聚合物mPEG-b-PTTMA-b-PGMAN(ETGN)。研究结果表明,伴生羟基能够有效地减弱阳离子聚合物ETGN对细胞膜的破坏作用,提升ETGN的细胞相容性。当N/P=50时,ETGN/siRNA复合物的生物活性依然可以达到90%。同时,ETGN可以高效地递送siRNA,当N/P=50(50nM siRNA)时,ETGN/siRNA的体外基因沉默效率可以达到95%。并且,ETGN/siRNA在皮下组织和肝脏中分别取得了80%和92%基因沉默效率。进一步研究表明,ETGN的pH敏感降解性能够有效地增强siRNA内涵体逃逸能力进而提升基因沉默效率。但存在的问题是提高了细胞相容性,却需要在高载体剂量(N/P=50)下才能获得高的基因沉默效率。
针对疏水内核pH敏感性促进siRNA内涵体逃逸,有必要进行深入探讨以获得更优化的载体结构。这一问题的研究需要弱化胞吞效率因素的干扰。为此,本文设计合成了系列三嵌段共聚物PCB-b-P(DMAEMA-co-DPA)-b-PG(GDDC),其中,DMAEMA(pKa=8.4)与DPA(pKa=6.0)共聚单元比例可以有效地调节疏水段的pH敏感性。同时,聚羧酸甜菜碱(PCB)上的羧基与阳离子段聚胍基(PG)的氢键配对作用抑制细胞对GDDC/siRNA复合物的胞吞。细胞胞吞结果证明GDDC/siRNA系列复合物的细胞胞吞率相近,约为商用试剂Lipo2000/siRNA的1/6。以GDDC系列纳米粒的解组装pH值作为载体pH敏感性的参数,对比研究GDDC/siRNA系列复合物的细胞内基因沉默效率和内涵体逃逸能力。结果表明,解离pH(pHd)为~6.8的纳米粒GDDC-4表现出最高的siRNA内涵体逃逸效率和基因沉默效率,当N/P=8(50nM siRNA)时,基因沉默效率几乎达到~100%,明显高于Lipo2000(65%)。而且,体内皮下注射后,GDDC-4能够将siRNA长时间抑留在皮下组织中,并取得80%的基因沉默效率。
基于上述研究获得的最佳pH敏感内核结构,进一步探讨作用机理。质子缓冲能力被认为是阳离子聚合物促进内涵体逃逸的作用机理,但仍存争议。为避免阳离子段PG、PCB质子缓冲作用的干扰,采用季铵化的PDMAEMA(PTDMAEMA)为阳离子段,PEG为亲水链,制备了系列三嵌段阳离子聚合物mPEG-b-P(DMAEMA-co-DPA)-b-PTDMAEMA(TDDE),TDDE系列载体的胞吞量差别可以忽略不计。研究了TDDE的质子缓冲能力与内涵体逃逸能力的关系,发现在早期内涵体中质子缓冲能力较强的聚合物能更好地促进siRNA内涵体逃逸。进一步地,早期内涵体的pH变化差值占聚合物质子缓冲域的比例越大,即K值越大,其siRNA内涵体逃逸效率越高。由此,筛选出聚合物TDDE-3,表现出最高的siRNA逃逸效率以及对包括心肌细胞H9C2在内的多种细胞均有较高的基因沉默效率。此外,季铵化的PDMAEMA,使TDDE系列载体的毒性明显下降,是降低PDMAEMA类载体毒性的又一有效途径。
最后,基于上述GDDC-4和TDDE-3的结构与siRNA递送效率的关系,进一步探讨平衡细胞相容性和递送效率的途径。合成了P(DMAEMA-co-DPA)-b-PG(GDD-4)和mPEG-b-P(DMAEMA-co-DPA)-b-PG(GDDE-4)两种载体,对比研究GDDC-4、GDDE-4、GDD-4、TDDE-3的siRNA递送效率和生物相容性。四种载体中,GDDE-4具有最强的siRNA递送能力,当在N/P=8,5nM siRNA时,GDDE-4的基因沉默效率依然可以达到80%。TDDE-3的细胞毒性最低,但其siRNA的胞内递送效率也最低。另外,通过对比发现,PEG化修饰是改善阳离子聚合物siRNA递送效率的有效方式。