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研究背景:肠结核是结核分支杆菌侵犯肠道后引起的慢性肉芽肿性炎症性疾病,约占结核病患者的2%,近年来由于流动人口的增加、HIV与结核分支杆菌伴发感染、以及多重耐药菌株的流行等原因,我国结核病防控工作面临严峻考验。克罗恩病是一种病因不明的胃肠道慢性非特异性肠道炎症性疾病,但目前普遍认为是由遗传易感性、粘膜免疫调节异常、肠道菌群和环境因素的相互作用导致肠道病理损伤。中国以往是克罗恩病的低流行地区,但随着工业化的发展进程和生活方式的逐渐西化,近几十年来发病率显著上升。由于两病流行病学的动态变化和具有相似的临床特征,鉴别诊断一直相当困难。肠结核误诊为克罗恩病而使用免疫抑制剂时可能导致结核感染的加重乃至全身播散,克罗恩病误诊为肠结核而进行抗结核治疗将使得患者承受不必要的药物毒副作用并延误治疗,因此找到两病在遗传易感性上的差异进而明确差异分布基因在疾病的发生发展中的具体作用机制将有助于疾病的鉴别及基因个体化治疗的实施。肠道中存在大量的黏膜相关淋巴组织,在肠结核和克罗恩病的发病过程中,黏膜免疫系统发挥着关键作用。以产生IL-17而命名的Th17细胞最近在粘膜免疫的研究中备受关注。Na?ve T细胞在接受抗原递呈细胞呈递信号及IL-23、IL-6、TGF-β和IL-1β等细胞因子复杂而精细的调控下可分化并维持为Th17细胞。Th17细胞能分泌IL-17、IL-22等多种细胞因子,既有促进炎症进展又有组织保护的作用,Th17细胞发挥病理生理功能的调节网络称为IL-23/IL-17轴。有关IL-23/IL-17轴基因单核苷酸基因多态性(SNPs)与疾病遗传易感性的相关研究已有广泛报道。鉴于肠结核及克罗恩病都是多基因调控的复杂疾病,我们推测位于IL-23/IL-17轴相关基因的SNP通过调控IL-17、IL-22等细胞因子的表达水平来影响疾病的发生发展,但其具体的分子机制尚不明确。本项目将通过临床大样本对肠结核和克罗恩病患者中IL-23/IL-17轴相关SNP的基因频率进行病例-对照研究,以期找到两病IL-23/IL-17轴基因型与表型的相关性,并进一步证实阳性关联发挥生物学效应的机制途径。研究方法:1、制定标准筛选拟研究的IL-23/IL-17轴相关基因功能性SNP位点。2、按诊断标准共随机筛选得符合条件的肠结核患者石蜡组织标本133例,克罗恩病患者石蜡组织样本128例,健康对照抗凝全血500例;整理研究对象的相关信息进行分析并分别抽提基因组DNA。3、按筛选出的SNP的位点对抽提到的基因组DNA使用TaqMan探针法进行分型。检验各位点下对照组基因型是否符合哈迪-温伯格平衡及多态性研究的统计效力,然后使用非条件logistic回归分析来分别比较肠结核、克罗恩病、健康人群之间的基因型和等位基因频率。以性别,年龄,吸烟和饮酒为协变量以调整OR值;并对有明显差异的SNP位点进行遗传模型分析。4、以pGL3-Basci Vector构建IL22基因启动子rs2227473_G(-1810G)表达质粒,然后进行定点突变获得突变体(-1810A)质粒,转染293T细胞,采用双荧光素酶报告基因系统对rs2227473位点的启动子表达活性进行检测。5、使用免疫荧光、免疫组化方法对肠结核、克罗恩病、肠息肉、结肠癌组织中的IL-22R1表达情况进行检测,并使用Image-Pro Plus 6.0软件分析免疫组织化学图像的平均积分光密度(IOD/Area)以评估不同疾病肠道组织中IL-22R1表达水平。研究结果:1、IL-23/IL-17轴基因SNP筛选、分型及其与疾病易感性的关联分析(1)共筛选确定4个SNP位点为研究对象(IL17(A)rs8193036,TGFβrs4803455,IL22 rs2227473,IL1βrs1143627)。(2)肠结核和克罗恩病组的男女性别比与健康对照组相比有显著性差异(p<0.05);T-SPOT阳性率和肺部影像异常结果均显示肠结核和克罗恩病组间存在显著差异(p<0.05)。(3)各位点下健康人群基因型都符合哈迪-温伯格平衡,且多态性研究Power值大于0.8。以IL22 rs2227473主要基因型GG为基线并调整性别、年龄、吸烟、饮酒协变量,在肠结核组和健康对照组中GA的分布存在显著差异(p=0.046,OR=0.57,95%CI=0.33-0.99),A等位基因的分布也存在显著性差异(p=0.030,OR=0.60,95%CI=0.37-0.95);以IL1βrs1143627主要基因型CC为基线并调整性别、年龄、吸烟、饮酒协变量,在肠结核组和健康对照组中CT的分布存在显著差异(p=0.033,OR=1.81,95%CI=1.05-3.13),TT的分布也存在显著差异(p=0.011,OR=2.17,95%CI=1.19-3.95),T等位基因的分布同样存在显著差异(p=0.014,OR=1.43,95%CI=1.07-1.89)。在显性遗传模型下,rs2227473A等位基因是肠结核患病的保护因素(p=0.04);在显性、隐形、共显性遗传模型下,rs1143627位点T等位基因是肠结核患病的危险因素(均p<0.05)。2、IL22 rs2227473功能性SNP调控基因表达的分子机制研究(1)测序显示pGL3-rs2227473_G重组质粒及pGL3-rs2227473_A突变质粒构建正确。(2)萤火虫/海肾荧光素酶值(F/R)在转染和空载体组之间显着不同,并且pGL3-rs2227473_A相对于pGL3-rs2227473_G的F/R显著增加。3、IL-22-IL-22R1相互作用在肠结核、克罗恩病中的初步探索(1)免疫荧光显示IL-22R1主要表达于肠绒毛上皮层中;且免疫组化提示肠结核和克罗恩病中的IL-22R1表达不限于上皮细胞,在肠道淋巴组织中观察到高IL-22R1表达,尤其是在肠结核样本中观察到在干酪样坏死区域周围的朗罕氏巨细胞普遍存在强烈的阳性染色。(2)与结肠息肉和结肠癌相比,肠结核和克罗恩病的免疫组化图像的平均积分光密度均显示出显著更高的IL-22R1表达(均p<0.05)。研究结论:(1)T-SPOT、肺部影像学检查对于鉴别肠结核和克罗恩病具有重要的临床价值;(2)IL-23/IL-17基因轴上的IL22 rs2227473 G等位基因和IL1βrs1143627 T等位基因多态性是肠结核患病的危险因素,而与克罗恩病无关;(3)IL22基因启动子区rs2227473 A等位基因的存在和IL-22高转录活性相关;(4)与肠息肉和结肠癌相比,肠结核和克罗恩病中IL-22R1的表达量明显增高。这种差异表达可能可以用于鉴定肠道疾病;更为重要的是IL-22R1在肠道淋巴组织中表达,特别是在多核巨细胞中高度表达说明IL-22R1的表达不只局限于非造血细胞,研究人员应该注意IL-22/IL-22R1系统治疗所带来的免疫方面的副作用。