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第一部分CD4+LAP+调节性T细胞在动脉粥样硬化小鼠中数量与功能变化目的：研究动脉粥样硬化(AS)模型小鼠体内潜伏相关肽(LAP)+调节性T细胞(CD4+LAP+Tregs)的数量与功能变化。方法：将6周大小雄性的C57BL/6J小鼠和ApoE-/-小鼠分为3组：1)10-wk C57BL/6J组(即C57BL/6J小鼠普通饮食4周)；2)10-wk ApoE-/-组(即ApoE-/-小鼠普通饮食4周);3)20-wk ApoE-/-组(即ApoE-/-小鼠普通饮食14周)。饲养一定时间后摘眼球取血、分离脾脏和胸腺组织。检测血浆总胆固醇、oxLDL和甘油三酯的含量。应用流式细胞术检测脾脏和胸腺中CD4+CD25+LAP+细胞及CD4+CD25-LAP+Tregs细胞的比例。应用3H-胸腺嘧啶核甘(3H-TdR)渗入法检测脾脏的CD4+LAP+是否能够抑制CD4+LAP-的增殖反应。应用ELISA法检测CD3抗体刺激后脾脏细胞培养上清中IL-17和IFN-γ的浓度。结果：10-wk ApoE-/-组血浆总胆固醇和ox-LDL浓度显著高于同龄的10-wk C57BL/6J组,20-wk ApoE-/-组总胆固醇和ox-LDL浓度明显高于10-wk ApoE-/-组。10-wk ApoE-/-组胸腺和脾脏中CD4+CD25+LAP+和CD4+CD25 LAP+Tregs比例明显低于10-wkC57BL/6J组,20-wk ApoE-/-组胸腺和脾脏中CD4+CD25+LAP+和CD4+CD25 LAP+Tregs比例明显低于10-wk ApoE-/-组。此外,20-wk Apo-/-组脾脏CD4+LAP+Tregs抑制功能显著低于10-wk ApoE-/-组和10-wk C57BL/6J组,而10-wk ApoE-/-组与10-wk C57BL/6J组无明显差异。20-wk ApoE-/-组脾细胞表达IFN-γ和IL-17明显高于10-wk ApoE-/-组和10-wk C57BL/6J组。结论：动脉粥样硬化小鼠血浆脂质水平明显高于正常小鼠。在动脉粥样硬化小鼠中,CD4+LAP+Tregs数量显著下降和功能明显受损,且体内炎症因子表达明显增高。第二部分去除CD4+LAP+调节性T细胞促进免疫炎症反应和小鼠动脉粥样硬化斑块形成目的：通过构建动脉粥样硬化模型,观察和探讨anti-LAP抗体是否能够去除CD4+LAP+Tregs,及其对动脉粥样硬化斑块形成和免疫炎症反应的影响。方法：将6周大小雄性的ApoE-/-小鼠分为2组：1)IC对照组(即ApoE-/-小鼠经腹腔注射50μg IgG1同型抗体,每天一次,连续五天,高脂饮食12周)；2)anti-LAP组(即ApoE-／-小鼠经腹腔注射50μg anti-LAP抗体,每天一次,连续五天,高脂饮食12周)。上述抗体干预于第9、12、15周重复,18周龄时分离血、脾脏、心脏、全主动脉。抗体干预24h后,流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+细胞(即Foxp3+Tregs)和CD4+LAP+Tregs比例,应用3H-TdR渗入法检测Foxp3+Tregs的功能变化和脾脏淋巴细胞增殖反应,分离脾脏淋巴细胞培养上清并应用ELISA检测IL-17和IFN-γ的浓度。动脉粥样硬化模型建立后,分离血浆并检测甘油三酯和总胆固醇的含量,油红O染色评估主动脉窦和全主动脉斑块面积,免疫组化染色检测主动脉窦斑块collagen、 TGF-β、CD4、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、α-SMA、CD68和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的含量,应用流式测定脾脏中Th1 (CD4+IFN-γ+)细胞、Th17(CD4+IL-17+)细胞和巨噬细胞Ml、M2的百分比,应用RT-PCR法检测动脉粥样硬化斑块内VCAM-1、IL-10、TGF-β、IL-17、MCP-1和IFN-γ mRNA的表达量。结果：与IC对照组相比, anti-LAP组脾脏CD4+LAP+细胞被去除了70%,而Foxp3+Tregs细胞的数量及功能并不受影响。anti-LAP组与IC对照组相比,脾脏淋巴细胞增殖能力明显升高,且其IFN-y和IL-17的蛋白表达明显增加。另外,IC对照组和anti-LAP组的甘油三酯和总胆固醇浓度无明显区别。与IC对照组相比,anti-LAP组主动脉窦和全主动脉斑块面积明显增加,anti-LAP组斑块内TGF-β、collagen和α-SMA含量显著减少,而CD4数量、CD68、MMP-2和MMP-9的含量均明显增加。anti-LAP组与IC对照组相比,脾脏Th17、Th1和M1细胞的数量增多,而M2细胞则下降。此外,anti-LAP能够显著上调主动脉VCAM-1、IFN-γ, IL-17和MCP-1 mRNA的含量,而下调TGF-β和IL-10mRNA的含量。结论：经腹腔注射anti-LAP抗体可有效去除ApoE-/-小鼠免疫器官中CD4+LAP+Tregs细胞。anti-LAP抗体能够促进动脉粥样硬化斑块形成和斑块不稳定,其机制为anti-LAP抗体能够去除CD4+LAP+细胞和下调抗炎因子TGF-p及IL-10,从而导致炎症因子IL-17、IFN-γ和MCP-1等显著增加。第三部分过继转输CD4+LAP+调节性T细胞减轻免疫炎症反应和小鼠动脉粥样硬化斑块形成目的：通过构建动脉粥样硬化模型,观察和探讨过继转输CD4+LAP+Tregs细胞对动脉粥样硬化斑块形成和免疫炎症反应的影响。方法：应用流式细胞术分选C57BL/6J小鼠脾脏的CD4+LAP+Tregs和CD4+LAP效应性T细胞(Teffs)用于过继转输和表型功能分析。流式检测上述两种细胞的纯度、LAP+细胞与Foxp3+细胞重叠比例、以及CD4+LAP+Tregs细胞表面CTLA-4和ICOS的表达水平。分离CD4+LAP+Tregs和CD4+LAP-Teffs细胞的上清并应用ELISA检测TGF-β和IL-10的浓度。另外,将6周大小雄性的ApoE-/-小鼠分为3组：1)PBS对照组(即ApoE-/-小鼠经尾静脉注射200μl PBS); 2) LAP+细胞组(即经尾静脉注射1×105个CD4+LAP+Tregs); 3) LAF细胞组(即经尾静脉注射1×105个CD4+LAP-Teffs)。上述干预于第9、12、15周重复,总共四次。经过12周高脂饮食,18周龄时分离血、脾脏、心脏、全主动脉。应用3H-TdR渗入法检测脾脏淋巴细胞增殖反应,分离脾脏淋巴细胞培养上清并应用ELISA检测IL-17和IFN-γ的浓度。检测血浆甘油三酯和总胆固醇含量。油红O染色评估主动脉窦和全主动脉斑块面积,免疫组化染色检测主动脉窦斑块TGF-β、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、CD4、α-SMA、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、CD68和collagen的含量,应用流式测定脾脏中Th1细胞、Th17细胞和巨噬细胞MI、M2的百分比,应用RT-PCR法检测动脉粥样硬化斑块内IL-17、VCAM-1、TGF-β、MCP-1、IFN-γ和IL-10mRNA的表达量。结果：经流式分选,CD4+LAP+细胞和CD4+LAFr细胞纯度分别可以达到90.5%和96%,经鉴定LAP+细胞几乎不含Foxp3。而且,CD4+LAP+细胞表面CTLA-4和ICOS的表达水平明显高于CD4+LAP细胞,以及前者分泌TGF-β和IL-10显著高于后者。另外,与PBS对照组相比,LAP+细胞组脾脏淋巴细胞增殖明显受抑,且IFN-γ和IL-17的蛋白表达明显减少。三组之间的总胆固醇和甘油三酯水平无明显差异。与PBS对照组相比,LAP+细胞组主动脉窦和全主动脉斑块面积明显减少,LAP+细胞组斑块内TGF-β、α-SMA和collagen含量显著增加,而CD68、CD4、MMP-2和MMP-9数量或表达明显减少。与PBS对照组相比,LAP+细胞组脾脏Th1、Th17、M1细胞比例明显减少,而M2则显著增加。此外,过继转输LAP+细胞能够上调主动脉IFN-γ、IL-17、MCP-1和VCAM-1 mRNA的含量,同时可下调TGF-β和IL-10 mRNA的含量。结论：CD4+LAP+Tregs细胞是一类有别于Foxp3+Tregs的调节性T细胞。过继转输CD4+LAP+Tregs细胞能够减轻动脉粥样硬化斑块形成和促进斑块稳定,其机制为CD4+LAP+Tregs能够分泌大量抗炎因子TGF-β和IL-10,后者可抑制IL-17、MCP-1和IFN-γ的生成。