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目的:观察并比较清热活血方、雷公藤多苷、甲氨蝶呤(MTX)三种药物对胶原诱导关节炎(CIA)大鼠滑膜组织B细胞、浆细胞浸润程度及白介素(IL)-21、B淋巴细胞趋化因子(CXCL13)、抗环瓜氨酸多肽抗体(CCP)表达功能的影响,探讨三种药物治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)对滑膜组织CD19+B细胞相关功能影响的作用机制,也为中药清热活血方治疗RA发挥综合治疗效果提供新的实验证据。方法:将60只健康SD大鼠(雌雄各半分笼饲养)按照体重随机区组分组分为5组,分别设为正常对照组、CIA模型组、雷公藤多苷组、清热活血方组、甲氨蝶呤(MTX)组。除正常对照组外,其余各组均使用牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂二次免疫诱导造模,形成CIA关节炎模型,首免与二免间隔一周。首次免疫第10天开始按照既定分组,分别给予生理盐水、雷公藤多苷片、清热活血方、MTX片灌胃给药干预。将雷公藤多苷片制备成0.625mg/ml浓度的混悬液,清热活血方煎取浓缩至以生药量为2g/ml浓度,甲氨蝶呤片制备1mg/ml浓度的混悬液,均严格以体重0.1kg·1ml的剂量灌胃,清热活血方与雷公藤多苷每天一次,MTX一周两次。每日记录体重变化,每隔3日,4日固定时限测量记录后肢肿胀程度。用药30天后各组大鼠均以水合氯醛麻醉后,腹腔主动脉采血后离心收集血清,使用ELISA法分别检测各组大鼠血清IL-21、CXCL13、CCP分子表达的定量。留取双下肢膝关节滑膜组织,每组采集3只(雌雄比为1:2),通过免疫组化试验检测滑膜中B淋巴细胞特异性膜蛋白分子CD19,浆细胞特异性膜蛋白分子C D138的表达,使用ImageProPlus6.0软件统计分析特异标记分子的平均光密度(MOD)值,剩余大鼠的滑膜组织分别使用Real-time PCR法检测各组滑膜组织IL-21、CXCL13、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)的mRNA表达水平;ELISA法检测滑膜匀浆IL-21、CXCL13、CCP分子表达的定量;Western-Blot法检测滑膜组织中AID的活化情况。留取下肢踝关节做病理HE染色切片,扫描观察并比较各组踝关节滑膜增生与骨破坏程度的差异。结果:1.关节肿胀度变化雌雄大鼠均于首次造模后第10天起开始出现关节肿胀,雄性在第21天时,雌性在第17天时,足肿胀程度达到最高峰。此后肿胀开始出现消退,相比与模型组,各组用药对大鼠足肿胀程度均有减缓作用,雌雄大鼠对三种药物的治疗反应表现出一致性,清热活血方组肿胀程度最低,雷公藤多苷次之,甲氨蝶呤对雌雄大鼠的肿胀程度控制稍差。在首免后第38天时,三种药物对大鼠足肿胀的抑制程度无明显差别。2.大鼠关节病理切片正常对照组大鼠关节结构完整,呈正常形态。模型组可见明显的滑膜增生,滑膜与骨质边缘出现融合迹象,骨质出现明显不规则侵蚀消融,双侧关节间隙明显狭窄或消失。清热活血方组较CIA模型组关节囊内滑膜组织增生程度较轻,关节连接部位未见大面积滑膜组织与骨质融合现象,关节面尚属完整,关节腔隙轻度狭窄;雷公藤多苷组大鼠关节囊内出现大面积滑膜与骨质融合迹象,出现轻度的骨侵蚀,两侧关节间隙几近消失;MTX组滑膜增生严重,出现大面积与骨质融合的迹象,与模型组情况近似,关节间隙基本消失。3.大鼠滑膜组织免疫组化实验相比于正常对照组,大鼠首次造模40天后滑膜组织出现大量的B淋巴细胞、浆细胞浸润,正常对照组只在血管周围B淋巴细胞标记分子比较明显,且正常对照组滑膜组织中几乎没有浆细胞浸润。通过统计分析比较特异标记物蛋白的MOD值,发现模型组滑膜组织有大量浆细胞浸润,与正常对照组比较有显著差异(P<0.001)。各用药组大鼠滑膜组织B细胞、浆细胞浸润数量,较模型组有不同程度减少。清热活血方与MTX对B细胞浸润的抑制程度接近,相较模型组有统计意义的改善(P<0.05),雷公藤多苷对B细胞浸润滑膜的抑制作用不明显,没有获得统计学所示差异,可能需要扩大样本量。清热活血方对浆细胞浸润程度的抑制作用最明显,与CIA模型组比较有显著差异(P=0.002,<0.01),雷公藤多苷对浆细胞抑制作用稍弱(P<0.05),而MTX对滑膜组织浆细胞的浸润程度似乎没有明显影响。4.血清细胞因子表达水平与正常对照组相比,CIA模型组血清中IL-21、CXCL13、CCP抗体含量明显升高(P<0.001);与模型组比较,清热活血方用药组大鼠血清中IL-21、CXCL13、CCP含量均降低(P值均<0.001)。雷公藤与MTX均能降低血清IL-21浓度,与模型组相比均显示出明显的统计学差异(P<0.001),但是对血清CXCL13均没有明显的影响(P>0.05)。但雷公藤相较于甲氨蝶呤能够降低血清CCP抗体的含量,而且与模型组相比有统计学差异(P=0.008,<0.01)5.滑膜组织匀浆细胞因子表达水平滑膜匀浆IL-21、CXCL13浓度总体水平较血清明显升高,而CCP没有此变化。模型组滑膜组织IL-21、CCP浓度均较正常对照组显著升高(P<0.001),CXCL13浓度升高与正常对照组有统计学差异(P<0.05)。雷公藤多苷、清热活血方、MTX均能显著降低滑膜组织IL-21的表达(P<0.001)。然而雷公藤与MTX对滑膜组织CXCL13浓度没有表现出下降,样本均值反比模型组升高,清热活血方虽能够降低滑膜组织内CXCL13浓度,但没有出现与血清所测近似的统计学差异(P>0.05),可能与样本量过少有关。三种药物均能够降低滑膜组织CCP抗体的水平,以清热活血方效果最显著(P<0.01),雷公藤多苷与MTX接近(P<0.05)。6.滑膜组织细胞因子mRNA的表达水平模型组CXCL13、IL-21mRNA的表达水平均显著高于正常对照组(P<0.01),雷公藤多苷、清热活血方、MTX对滑膜组织中IL-21mRNA表达表现出相似的抑制作用(P值均<0.05)。只有清热活血方对CXCL13mRNA表现出抑制作用(P<0.05)。本研究发现活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)在CIA造模后出现升高,与正常对照组有统计学差异(P<0.05)。三种药物均表现出对AID酶的降低,但无统计学意义(P>0.05)。7.各组滑膜AID酶的Western Blot检测结果与正常对照组相比,CIA模型组大鼠滑膜AID酶水平明显升高;三种药物对滑膜中AID酶有不同程度的抑制作用,与MTX和雷公藤多苷组比较,清热活血方对AID酶的抑制作用较强,与PCR实验表现出类似的结果。结论:1.清热活血方、雷公藤多苷、MTX均可以减轻CIA大鼠关节肿胀度,从关节病理切片来看,清热活血方与雷公藤多苷能够减轻CIA大鼠的骨质破坏。2.清热活血方能够明显地抑制CIA大鼠滑膜组织B细胞、浆细胞的浸润程度。雷公藤多苷对浆细胞浸润程度的抑制作用较MTX明显,MTX对滑膜组织B细胞表现出抑制作用,但对浆细胞浸润影响较小。3.清热活血方对CIA模型大鼠血清与滑膜组织IL-21、CXCL13、CCP抗体均有明显抑制作用。与模型组相比,雷公藤多苷与MTX虽然对IL-21表现出一定的抑制作用,但对CXCL13却没有表现出抑制作用。4.清热活血方可能通过抑制IL-21、CXCL13的表达,并影响CIA大鼠滑膜组织B细胞、浆细胞的浸润并削弱其功能,从而抑制关节骨质破坏。