目的：　　 疟疾由按蚊叮咬传播，是一类严重危害人类健康的传染性寄生虫病，在全球有着很高的发病率和致死率。因此根除疟疾成为全球性的共同目标。由于疟原虫对抗疟疾药品耐药性和蚊虫对杀虫剂抗药性的产生及扩散，人类与疟疾之间的斗争日趋激烈。因此，研制安全有效的疫苗对于控制疟疾的流行起着关键作用。疟原虫生活史复杂，基因组庞大，其候选抗原也多，并且很多抗原所产生的免疫保护性不强等众多原因，给疟疾疫苗的研制带来了重重困难。虽然全世界科学家付出了极大的努力，但到目前为止，仍然没有一种有效的疫苗问世。根据疟原虫的生活史，目前疟疾疫苗的研制主要分三类:红外期疫苗，红内期疫苗以及传播阻断疫苗。最近，红内期全虫疫苗被证实它能够保护宿主抵抗多种疟原虫攻击，这种保护作用主要由CD4+T细胞所介导，这也许能为红内期亚单位疫苗的设计提供一种新的策略。在红内期疟原虫中，由于裂殖子存在于细胞外，与宿主免疫系统直接接触，因此这一时期原虫已成为红内期疫苗的主要靶点。裂殖子入侵宿主细胞是个相当复杂的过程，并由受体和配体介导。其中EBL家族在介导疟原虫粘附、识别和入侵适宜宿主红细胞的过程中发挥重要作用，在裂殖子侵入红细胞的过程中是必不可少的成分，成为疟疾疫苗的重要候选抗原分子。　　 基于以上研究，本实验以致死型约氏疟原虫EBL蛋白作为研究对象。拟构建编码该蛋白功能片段的真核表达载体，pcDNA3.1(+)-ebl-Ⅱ，进行动物免疫，观察其免疫活性。以期筛选出优势靶抗原，为进一步研究有效的疟疾疫苗提供理论基础。　　 方法：　　 一、约氏疟原虫EBL-Ⅱ基因片段的获取　　 1、约氏疟原虫基因组DNA的提取　　 用第三代致死型约氏疟原虫感染野生昆明鼠，感染第四天小鼠眼球取血，按照天根生化科技有限公司的血液基因组提取试剂盒说明书，提取疟原虫基因组DNA。　　 2、PCR方法扩增EBL-Ⅱ基因片段并回收纯化　　 设计一对引物（引物含起始密码子、终止密码子、酶切位点、保护碱基、免疫刺激序列），以基因组DNA为模板，PCR扩增EBL-Ⅱ片段并回收。　　 二、pcDNA3.1(+)-ebl-Ⅱ表达载体的构建　　 1、真核表达载体的构建及鉴定　　 将所获的目的片段及pcDNA3.1(+)载体双酶切，琼脂糖凝胶电泳后分别回收所需目的片段及开环的pcDNA3.1(+)载体，用T4连接酶将二者连接，命名为pcDNA3.1(+)-ebl-Ⅱ。重组质粒转化到TG-1菌，挑取平板上生长的可疑阳性菌落进行增菌，提取质粒后用BamHI及XhoI双酶切鉴定并测序。　　 2、重组质粒的大量制备　　 获得预期的测序结果后，按照天根生化科技有限公司无内毒素质粒大量提取试剂盒的说明，大量提取质粒pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)-ebl-Ⅱ，供转染和免疫使用。　　 三、质粒pcDNA3.1(+)-ebl-Ⅱ在真核细胞COS7中瞬时表达　　 将构建的质粒pcDNA3.1(+)-ebl-Ⅱ转染处于指数生长期的COS7细胞，培养48小时后用间接免疫荧光的方法检测其在细胞中的表达情况。　　 四、质粒pcDNA3.1(+)-ebl-Ⅱ在动物体内免疫作用的检测　　 1、动物的免疫　　 取6～8周龄雌性BALB/c小鼠57只，随机分为3组，其中两组分别在小鼠股四头肌注射质粒pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)-ebl-Ⅱ，注射体积100μl，浓度1μg/μl;第3组注射相同体积生理盐水。实验动物每三周加强免疫一次，每次免疫前三天注射盐酸利多卡因0.25mg/只。共免疫3次。　　 2、免疫小鼠血清中抗体的检测　　 每免疫两周后，每组处死三只鼠，小鼠眼球取血，分离血清。用ELISA方法检测血清中IgG抗体及其亚类的浓度。　　 3、免疫小鼠脾细胞培养上清液中细胞因子的检测　　 每次免疫两周后，小鼠取脾，进行脾细胞培养，48小时后，用ELISA方法检测脾细胞培养上清液中IFN-γ、 IL-2、IL-4、IL-10的浓度。　　 4、统计学分析　　 所有数值以均数±标准差（(X)±SD）表示，采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行分析，组间每两组比较采用独立样本t检验分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。　　 结果：　　 一、获取约氏疟原虫EBL-Ⅱ基因片段　　 1、提取出致死型约氏疟原虫基因组　　 按照天根生化科技有限公司的血液基因组提取试剂盒说明书，提取产物经琼脂糖凝胶电泳后，获得一条较明亮的条带，即所提取的疟原虫基因组DNA。　　 2、PCR方法扩增出EBL-Ⅱ基因片段　　 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，获得大小约为1000bp的产物条带，与预期结果(987bp)一致。　　 二、真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ebl-Ⅱ的鉴定　　 重组质粒经BamHI及XhoI双酶切后琼脂糖凝胶电泳，获得两条带，大小分别约为5000bp和1000bp，与预期结果(5300bp，987bp)一致。TaKaRa公司的测序结果与Genebank中EBL-Ⅱ基因序列比对，同源性达100％。　　 三、质粒pcDNA3.1(+)-ebl-Ⅱ在真核细胞COS7中的瞬时表达　　 间接免疫荧光显示，转染质粒pcDNA3.1(+)-eb1-Ⅱ后的细胞浆中出现黄绿色荧光，核着蓝色，而对照组即空质粒pcDNA3.1(+)组仅核着蓝色，胞浆并无绿色荧光。说明构建的pcDNA3.1(+)-ebl-Ⅱ能在真核细胞中正常表达。　　 四、重组质粒在动物体内免疫效应的检测　　 1、小鼠血清IgG抗体及其亚类的检测　　 实验组即pcDNA3.1(+)-ebl-Ⅱ组小鼠血清总IgG、IgG1、IgG2a水平均明显高于空白对照组（生理盐水组）及阴性对照组(pcDNA3.1(+)组）(P＜0.05);整个过程中，空白对照组和阴性对照组之间各类抗体均没有统计学差异（P＞0.05）。　　 2、小鼠脾细胞培养上清液中细胞因子的检测　　 实验组小鼠细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-2水平均高于空白对照组及阴性对照组(P＜0.05);整个过程中，空白对照组和阴性对照组之间没有统计学差异（P＞0.05）。　　 结论：　　 1、成功构建了致死型约氏疟原虫pcDNA3.1(+)-ebl-Ⅱ真核表达载体。　　 2、动物实验表明，pcDNA3.1(+)-ebl-Ⅱ可以诱导体液和细胞免疫应答，具有良好的免疫效应。