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背景中枢神经系统的发育是一个十分复杂的过程,尤其是大脑皮层的发育过程。在大脑皮层发育过程中,神经元迁移在其中扮演者重要的角色,神经元只有在正确的时间迁移到正确的位置,才能够形成正确的神经回路,进而发挥其相应的功能。神经元迁移存在三种模式,分别为多极化迁移、胶质细胞依赖和胞体转移的迁移。早期神经元主要以胞体转移的方式进行迁移,而后期产生的神经元依次通过上述三种迁移模式进行迁移,并且在此过程中有许多分子和信号通路参与其中。有报道称在胚胎发育早期阶段,Rap1通过Reelin信号通路调节神经元的迁移。然而,有研究表明在后期神经元中也检测到Rap1的活性,只是磷酸化位点不同,因此,我们推测,在后期神经元迁移过程中,Rap1可能参与其中,但可能通过其它信号通路来调节神经元迁移。Rap1gap是Rap1的抑制因子,本实验通过异常表达Rap1gap进而研究Rap1在大脑皮层发育过程中的功能。目的1.探索Rap1是否参与调节后期神经元迁移。2.进一步研究Rap1通过何种信号通路来影响后期神经元迁移。方法1.用脂质体3000将Rap1超表达载体(p CAGGS-Rap1gap)和干扰载体(Rap1gapsh RNA1和Rap1gap-sh RNA2)转入CHO细胞,提取蛋白,利用Western blot检测所用载体是否能够实现Rap1gap超表达或抑制表达。另外,利用鸡胚活体原位电转基因技术将Rap1gap超表达载体和干扰载体转染到E2.7鸡胚脊髓中,E5取材做脊髓横向切片,然后通过荧光免疫组化检测Rap1gap是否超表达或抑制表达。2.利用鸡胚活体原位电转基因技术,将p CAGGS-Rap1gap、Rap1gap-sh RNA1和Rap1gap-sh RNA2转入E4鸡胚视顶盖中,并在鸡胚发育至E9时取材。此外,用小鼠子宫内电转技术将p CAGGS-Rap1gap转入E16胎龄小鼠大脑皮层室管膜区,E19取材。将上述取得的材料进行固定、脱水、包埋、切片后,应用GFP示踪检测Rap1gap异常表达之后是否会影响神经元形态及其神经元迁移。3.将脂质体转染后的CHO细胞做荧光免疫组化,检测Rap1gap、Tubulin、Vinculin、F-actin、NF的表达,并且观察细胞形态变化。4.为了研究Rap1是通过哪些分子和信号通路来影响神经元迁移,本实验通过Western Blot检测Rap1gap异常表达之后,再检测β-catenin、N-cadherin、PI3K、PKC、AKT、Tubulin、vinculin和F-actin的表达变化,进而分析Rap1是调控哪些分子及信号通路来调节神经元迁移。5.为了探索Rap1是否通过调控N-cadherin进而影响神经元迁移,本研究再次利用小鼠子宫内电转技术将N-Cadherin抑制表达,观察神经元迁移是否受到影响,神经元形态是否改变,及Western blot检测Tubulin、Vinculin和F-actin的表达。结果1.Rap1gap超表达载体(p CAGGS-Rap1gap)和干扰载体(Rap1gap-sh RNA1和Rap1gap-sh RNA2)转入CHO细胞及鸡胚脊髓后,CHO细胞Western blot及脊髓免疫荧光结果均表明,p CAGGS-Rap1gap可以实现Rap1gap在CHO及其鸡胚脊髓中超表达,并且Rap1gap-sh RNA1和Rap1gap-sh RNA2都可以成功抑制Rap1gap的超表达,而且Rap1gap-sh RNA1干扰效果更优。2.通过活体电转技术成功实现Rap1gap在鸡胚视顶盖和小鼠大脑皮层超表达和抑制表达。免疫组化结果表明,Rap1gap在鸡胚E9视顶盖超表达,即Rap1活性受到抑制,绝大多数神经元的迁移受到影响,无法正常向上进行迁移,并且神经元形态改变,神经元轴突变短甚至无轴突,但Rap1gap抑制表达之后,即Rap1激活增加时,神经元迁移与对照组相比无明显差异。另外,与此一致,Rap1gap在E19胚龄小鼠大脑皮层超表达后,神经元无法向外层进行迁移,神经元停留在室管膜区(VZ),并且神经元的形态发生了改变,神经元无轴突或轴突较短。3.Rap1gap转入CHO细胞后,免疫荧光结果显示,Rap1gap在CHO细胞中超表达,并且通过标记细胞骨架蛋白表明Rap1gap超表达的细胞形态均发生改变,细胞形态趋于球形。4.当Rap1gap在CHO细胞中超表达时,β-catenin及N-Caderin都受到了影响,并且细胞骨架蛋白Tubulin、F-actin的表达显著降低,另外一些与形态相关的激酶也表达发生改变,如PI3K、PKC的表达量降低。5.在胎鼠大脑皮层中,N-cadherin表达被抑制之后,与Rap1活性抑制之后一致,绝大多数神经元都停留在室管膜区,并且神经元形态发生了改变,另外Western blot检测到一些骨架蛋白如Tubulin、F-actin的表达也明显降低。结论1.Rap1参与调控后期神经元的胶质细胞依赖方式的迁移2.Rap1是通过N-cadherin调节神经元形态进而影响迁移