肝脏是人体各种物质代谢、能量转换及供应的枢纽和主导器官,是机体内多种重要信息调控分子的“集散地”。与其他器官不同,肝脏具有强大的再生能力。创伤和各种肝病后,残存肝组织很快会进入复杂的再生过程。肝再生一直是哺乳动物肝脏研究中的一个重要焦点。研究肝再生分子机理必将对肝脏移植、创伤、各种肝病及肝肿瘤诊治具有重要意义。因为肝细胞再生的机制非常复杂,影响因素众多,目前尽管对肝再生进行了大量分子生物学研究,但是对肝再生的分子机理,尤其是肝再生启动和终止的机制仍不清楚。 到目前为止,对肝再生的研究大多集中在基因水平,蛋白质整体水平的研究还相对较少。蛋白质组学(proteomics)的诞生为肝再生的研究提供了一个很好的平台。蛋白质组学是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。由于其研究的是生命活动的直接体现者和执行者-蛋白质,因此更接近生理或病理的本质。差异蛋白质组是蛋白质组学研究的一个主要内容,其核心在于寻找某种特定因素引起样本之间蛋白质组的差异,揭示并验证蛋白质组在生理或病理过程中的变化。亚细胞蛋白质组学(subcellularproteomies)极大的降低了针对全细胞蛋白质组学研究的复杂性,已日益成为蛋白质组学研究的一个焦点。其一方面可以明确各种亚细胞的蛋白组成,促进对其结构和功能的理解,另一方面可以获得新蛋白质的亚细胞定位信息,促进对其生物学功能的认识。 线粒体(Mt)是真核细胞内一重要的亚细胞,除作为能量生产场所外,已发现其参与了多种细胞生理病理活动,大量研究表明线粒体直接参与了肝再生过程。然而线粒体在肝再生中的具体作用并不清楚,肝再生中线粒体蛋白的整体改变也没有研究。本研究通过建立大鼠肝再生模型,利用蛋白质组学方法,从亚细胞-线粒体蛋白质整体水平对肝再生过程进行研究,将有利于阐明肝细胞再生的分子机理,丰富对肝损伤和术后肝再生修复机制的认识和了解,为再生医学的发展奠定基础。 第一部分 肝再生过程中线粒体差异蛋白质组学研究 本部分研究中我们建立了经典的大鼠肝再生模型,SD大鼠随机分为70％肝部分切除组(PH组)和假手术对照组(Sham-operated,SH组),每组5只动物。PH组大鼠在无菌条件下切除肝左叶和中叶(约为全肝的70％);SH组大鼠同样开腹,但不切肝。70％PHx 24 h(早期),72 h(中期),168 h(晚期)后,处死大鼠,迅速取右叶肝组织,Nycodenz密度梯度离心分离亚细胞Mt,提取Mt蛋白,以SH组为对照,进行双向凝胶电泳分离蛋白,PDQuest7.4软件对双向电泳图谱进行分析,找出与肝再生相关的差异蛋白。对肝再生早期的差异蛋白进行了质谱鉴定,生物信息学分析。同时,对部分差异蛋白分别进行了mRNA和蛋白水平验证。在肝再生早期,我们共筛选出25个差异表达蛋白点(P<0.05),与SH组相比,PH组中上调的蛋白点有3个；多数下调,有22个。质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术成功鉴定出其中22个差异蛋白。经生物信息学分析这些差异蛋白参与了多条代谢途径,如糖代谢,脂代谢,呼吸链和氧化磷酸化,生物转化以及信号转导等。这些结果表明70％PHx后,肝细胞Mt通过多条代谢途径对肝再生进行调节,提示Mt很可能在肝再生早期发挥着重要的作用。研究发现肝再生早期-PH 24h,肝细胞生长出现一停滞阶段,推测可能与此时Mt蛋白下调,功能下降相关,提示Mt可能是肝再生过程中一个重要的调节点。 第二部分 差异蛋白Prohibitin(PHB)的功能探讨 Proh-bitin作为线粒体内膜的一保守蛋白,报道其与多种细胞活动相关,如肿瘤抑制、周期调节、转录调节、增殖、凋亡、衰老等。到目前为止,其许多功能和作用机制仍然不是很清楚。Prohibitin在各种疾病中的作用研究较多,在肝再生过程中的研究很少。我们发现肝再生早期Mt内的Prohbitin表达下调,考虑到Prohibitin与多种细胞活动相关,而肝再生是一复杂过程,多种细胞活动参与其中,推测其很可能在肝再生过程中发挥重要作用。因此,我们对肝再生过程中Prohibitin的表达,亚细胞分布以及功能进行了研究。 本部分研究包括体内和体外实验两部分。通过体内实验,我们发现：肝再生过程中Prohibitin的mRNA和蛋白表达水平呈现出相同的变化,均为早期降低,增殖期轻微上升,晚期明显上升,但蛋白变化不如mRNA变化明显,说明体内Prohibitin存在翻译后修饰；Prohibitin在大鼠肝细胞中主要位于Mt内,核中也有,但我们在胞液中未检测到；肝再生过程中Mt内Prohibitin的蛋白表达早期下降,增殖期升高,晚期恢复正常水平,结合实验中检测到的降低的Mt量在肝再生过程中逐渐升高以及改变的Mt超微结构逐渐恢复正常,我们推测Mt内的Prohibitin在肝再生过程中具有促进Mt的重建与稳定的作用；肝再生过程中核内的Prohibitin的蛋白表达呈上升趋势,尤其在肝再生晚期明显增多,结合实验中检测到的肝再生过程中PCNA指数的降低,凋亡蛋白酶活力的增高,同时结合国外报道,我们推测核中的Prohibitin可能参与肝再生过程中增殖与凋亡的调节。在体外,通过培养正常大鼠肝细胞(BRL-3A),细胞转染,Prohibitin RNA干扰和Prohibitin过表达我们进一步探讨了Prohibitin的功能,结果发现：①Prohibitin具有维持大鼠肝细胞Mt膜电位稳定的作用；②Prohibitin能抑制大鼠肝细胞细胞周期的进入,阻止细胞从G1期到S期转换；③ProhIbitin具有抑制细胞凋亡的作用。结合体内和体外实验,我们发现Prohbitin在肝再生中的作用,可能包含mRNA和蛋白两个水平的调节。实验结果显示Prohibitin在肝再生过程中发挥重要的作用。其一,Prohibitin参与肝再生过程中Mt的重建,与Mt的稳定和功能相关。其二,Prohibitin通过抑制细胞周期的进入,来抑制肝再生过程中肝组织的过度增殖,同时能抑制细胞凋亡,从而调节增殖与凋亡间的平衡。 总之,我们首次通过2-DE和质谱技术对肝再生过程中线粒体蛋白质组的改变进行了研究。应用亚细胞蛋白质组学的方法研究线粒体蛋白的差异表达,不仅有利于阐明肝再生的分子机制,同时为研究线粒体在其它疾病中的作用提供了一个很好的技术路线。肝再生早期的线粒体差异蛋白,经分析参与了多条代谢途径。我们指出了这些差异蛋白的几种细胞功能,不仅用于研究肝再生,对以后的深入研究也有重要的意义。同时,我们首次证实了Prohibitin在肝再生中具有维持线粒体稳定,参与线粒体重建的作用以及调节肝再生过程中增殖与凋亡间平衡的功能,取得了一些有意义的结果。Prohibitin在肝再生过程中的作用机制有待于进一步研究。