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研究背景:胰腺癌的发病率逐年上升,早期诊断困难,进展迅速,预后极差。神经侵袭是胰腺癌较为独特的侵袭转移方式,涉及肿瘤细胞和神经之间的信号相互作用。胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)家族的四个成员及其相应的受体在胰腺癌中都有不同程度的表达。其中神经营养因子Artemin能够促进多种不同神经的生存,并具有轴突导向作用;Artemin还在胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和子宫内膜癌等多种肿瘤中存在异常表达,影响这些肿瘤的致瘤性和侵袭力。研究目的:从细胞水平、组织水平和动物水平研究Artemin在胰腺癌生长侵袭中的作用,探讨靶向抑制Artemin蛋白表达对胰腺癌的潜在治疗作用。研究方法:1.用Western blot法检测11例胰腺癌及配对癌旁组织、6株胰腺癌细胞株的Artemin蛋白表达情况;用组织芯片免疫组织化学(IHC)方法检测100例胰腺癌(60例导管腺癌、40例腺鳞癌)的Artemin蛋白表达,分析其与各临床病理学参数的关系;用生长相关蛋白(Growth associated protein43,GAP-43)IHC染色结合图像分析计数胰腺间质神经纤维的数量和面积,分析Artemin蛋白表达与胰腺癌间质神经纤维肥大增生的关系。2.构建Artemin真核表达质粒和4种RNA干扰(RNAi)质粒,用脂质体法转染Panc I细胞,建立稳定转染Artemin过表达质粒和RNAi质粒的单克隆株,并利用Western blot法和qRT-PCR法筛选出过表达和RNAi效率最高的细胞株;用MTT法绘制细胞生长曲线,用流式细胞仪检测各组细胞周期和AnnexinV法检测细胞凋亡,并通过克隆形成试验、划痕试验、Transwell小室基质胶侵袭实验等比较各组细胞克隆形成、迁移、侵袭等生物学行为;收集Artemin过表达细胞和RNA干扰细胞的培养液上清,处理PC12细胞,观察各组细胞生长和神经元样分化情况,比较各组癌细胞的神经营养活性。3.利用Artemin过表达和RNA干扰的稳定转染细胞株,建立裸鼠原位移植瘤动物模型,观察成瘤组织的大体和显微镜下特点,比较各组肿瘤大小、周围器官侵犯、神经侵犯、脉管癌栓及淋巴结转移等情况;GAP-43IHC染色结合图像分析计数胰腺间质神经纤维的数量和面积,比较各组间质神经纤维肥大增生的情况。结果:1.胰腺癌组织中的Artemin表达水平显著高于癌旁组织,6株胰腺癌细胞株中都有不同程度的Artemin表达;免疫组化检测表明Artemin在胰腺癌组织中的阳性率(71.0%)显著高于癌旁组织(43.5%),阳性定位于癌细胞、癌旁管状复合物、间质神经纤维及动脉壁;Artemin在癌组织中的表达与胰腺癌的组织病理类型、性别年龄、部位、大小、分化程度和周围器官侵犯等临床病理学参数无关,而与淋巴结转移和神经侵袭的发生有关;胰腺癌间质中可见明显的神经病理学改变,包括神经纤维肥大、增生及癌细胞侵犯神经。Artemin阳性组神经纤维的平均数量(49.72±5.177/cm2)和面积(0.328±0.058mm~2)均显著高于Artemin阴性组神经纤维平均数量(28.72±4.248/cm2)和面积(0.0857±0.025mm~2)。2.在胰腺癌细胞中持续过表达Artemin增加了癌细胞克隆形成、细胞迁移、基质胶侵袭等能力,细胞培养上清能够诱导PC12细胞的神经元样分化;RNA干扰能够显著抑制癌细胞的克隆形成、迁移及侵袭力,细胞培养上清对PC12的诱导分化作用也不明显;Artemin过表达或抑制对胰腺癌细胞生长曲线、细胞周期和细胞凋亡均无明显影响。3. Artemin过表达细胞与空载体对照相比,能够增加裸鼠原位移植肿瘤的大小,在体内能够促进癌细胞向周围器官侵袭,增加神经侵袭及脉管侵袭的几率,并促进癌旁神经纤维增生; ArteminRNAi组细胞成瘤率降低、肿瘤体积更小,侵袭周围器官的现象减少,神经纤维数量减少,也未见脉管癌栓、淋巴结转移及神经侵犯现象。结论:1.胰腺癌组织表达的Artemin蛋白参与了胰腺癌间质中神经肥大与增生等病理改变,并与癌细胞的淋巴结转移和神经侵袭的发生有关。2.胰腺癌细胞表达的Artemin在体外能够促进自身存活,增强癌细胞的迁移能力和侵袭力,并通过旁分泌作用产生了神经营养属性;Artemin RNAi能够显著抑制这些作用。3.在胰腺癌细胞中强制表达Artemin蛋白能够增加原位移植瘤的体积,促进移植瘤向周围器官、脉管及神经侵袭,刺激间质神经纤维增生;靶向抑制Artemin表达对胰腺癌生长侵袭具有明显的抑制作用,可能成为胰腺癌治疗的潜在新靶点。