论文部分内容阅读
研究背景：卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的疾病。其中90%被归类为上皮性卵巢癌(EOC)。大多数的EOC患者在初诊时就为晚期,5年总生存率约为40%。侵袭和转移过程仍然是导致EOC患者复发和死亡的主要原因,但是其分子机制并不完全清楚。大量研究表明,上皮间质转化(EMT)在调节肿瘤转移的过程中发挥了至关重要的作用。越来越多的证据表明,EMT在上皮性卵巢癌细胞获得侵袭及转移能力方面有着非常关键的作用。由此可见,抑制EMT的靶向治疗将使EOC患者获益。大黄素,化学名为1,3,8-三羟基-6-甲基葸醌,它是一种从虎杖、大黄等的根茎中提取出来的一种蒽醌类衍生物。大黄素对多种癌症具有抗肿瘤效应,其中包括EOC。一项研究阐明,大黄素对A2780(紫杉醇敏感株)和A2780/taxol(紫杉醇耐药株)均具有抑制细胞增殖和诱导凋亡的效应,这种作用是通过减少抗凋亡分子的表达,例如survivin、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)。此外,大黄素可以通过抑制基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达从而抑制HO-8910PM细胞侵袭和转移。一项体外实验研究同样说明,大黄素对SKOV3和H08910细胞的侵袭具有抑制效应。但是,大黄素抑制侵袭和转移的分子机制并不清楚。其它癌症的相关研究表明,大黄素具有抑制结直肠癌、宫颈癌和头颈鳞癌细胞侵袭和转移的效应,这种作用与抑制EMT和WNT/β-catenin信号通路的失调节有关。因此,我们假设大黄素可能通过调节WNT/β-catenin信号通路来抑制上皮性卵巢癌细胞发生EMT,从而减弱其侵袭和转移能力。目的：探讨大黄素对上皮性卵巢癌细胞侵袭、转移和上皮间质转化的作用及其机制。方法：1.倒置显微镜观察A2780、OVCAR-3和SK-OV-3细胞的形态。2.CCK-8法检测大黄素对A2780和SK-OV-3细胞增殖能力的影响。3. Transwell小室检测A2780、OVCAR-3和SK-OV-3细胞的相对侵袭能力和大黄素对A2780和SK-OV-3细胞侵袭能力的影响。4. Western blot检测大黄素(0,10,20,40 μM)作用后以及糖原合成激酶-3β(GSK-3β)酶抑制剂10 μM SB216763预处理后,A2780和SK-OV-3细胞中上皮表型E-cadherin、keratin,间质表型vimentin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9以及相关通路指标GSK-3β, p-GSK-3βSer9, β-catenin和转录因子ZEB1的表达变化。5. ZEB1 siRNA作用于A2780和SK-OV-3细胞后,检测大黄素对细胞的侵袭能力和上皮间质转化的影响。结果：1.A2780、OVCAR-3和SK-OV-3细胞的形态和相对侵袭能力的检测：低侵袭能力的OVCAR-3细胞和高侵袭能力的A2780、SK-OV-3细胞分别显示出上皮性与间质性的形态及分子表达。2.大黄素对A2780和SK-OV-3细胞增殖、侵袭和上皮间质转化的影响：大黄素(20 μM)对A2780和SK-OV-3细胞增殖无明显的抑制作用(P>0.05)。大黄素(20 μM)作用后细胞的侵袭能力明显减弱(P<0.01)。大黄素(0,10,20,40 μM)作用48小时后,上皮表型E-cadherin和keratin表达明显增加,间质表型vimenti、N-cadherin、MMP-2和MMP-9表达明显减少,且表型表达变化呈药物浓度依赖性。3.大黄素抑制A2780和SK-OV-3细胞发生上皮间质转化的机制研究：大黄素(0,10,20,40 μM)作用48小时后,上皮间质转化相关通路指标p-GSK-3βSer9,β-catenin表达明显减少,呈药物浓度依赖性,GSK-3p表达无明显改变；转录因子ZEB1表达明显减少,呈药物浓度依赖性。应用10 μMGSK-3β酶抑制剂SB216763预处理6小时后,大黄素(20 μM)继续处理48小时,大黄素的以上作用明显减弱。4.大黄素抑制A2780和SK-OV-3细胞发生上皮间质转化的机制的验证：大黄素单独作用组与应用ZEB1 siRNA预先转染的细胞加入大黄素作用组相比,GSK-3p酶活性和β-catenin没有明显变化。应用ZEB1 siRNA预先转染的细胞再加入大黄素作用组与单独应用ZEB1 siRNA转染组或大黄素单独作用组相比,A2780和SK-OV-3细胞的侵袭能力更低,vimentin表达更低,·keratin表达更高,相应地,ZEB1的表达水平也是最低的(P<0.01)。结论：1.大黄素能够明显抑制上皮性卵巢癌细胞的侵袭、转移能力和上皮间质转化过程。2.大黄素抑制上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化是通过调节GSK-3β/β-catenin/ZEB1信号通路的机制完成的。