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本文将铁氰化钾与微生物传感技术有效结合,研究了以此为基础的全细胞型传感器在快速生化耗氧量(biochemical oxygen demand,BOD)及毒性(toxicity)检测方面的应用。结果显示,以铁氰化钾为媒介体(ferricyanide-mediated,FM)的BOD(FM-BOD)技术可有效地减少有机物降解的时间。并且当该技术采用标准曲线法作为内源呼吸的校正时,与以前报道的结果相比较,其线性范围及稳定性均有提高。以铁氰化钾为媒介体的毒性(FMtox)检测技术对多种毒物均有灵敏响应,可作为国际标准化组织(ISO)规定的标准方法和中华人民共和国国家标准法(GB)的有效补充,应用于一些不适于采用光学方法测试的毒性分析领域。具体的工作内容分章介绍如下:
第一章主要介绍了水体污染的定义、来源、特点及危害等,并且简单地归纳了可应用于水体监测的物理、化学、物理化学及生物学检测方法的优缺点。着重介绍了以微生物作为分子识别元件的生物传感器的一些相关知识,特别是以此为基础发展起来的FM型全细胞传感器的发展历史、构造和原理及其应用。
第二章主要介绍了可应用于水体中的可生物降解的有机污染物检测的FM-BOD技术的原理及特点。考虑到微生物自身的特性,测试过程中,我们首次提出了采用标准曲线法替代传统的空白溶液法校正微生物的内源呼吸。结果证明了标准曲线法可切实、有效地减少实验误差,可替代传统的内源校正方法广泛应用于快速BOD检测。
第三章的研究内容划分为两大部分。第一部分为FMtox的前期准备工作。主要讨论了不同浓度的铁氰化钾对模型微生物-Escherichia coli(E.coli)的毒性及其损伤机理。研究表明,高浓度的铁氰化钾不仅可以抑制E.coli的呼吸作用,还会损伤细胞的形态。但是在60min内,铁氰化钾的浓度<50.0 mmol/L时,其对细胞的损伤程度在允许范围内。最终,我们选取了45.0mmol/L作为铁氰化钾在FMtox实验中的使用浓度。本章的第二部分首先介绍了FMtox的工作原理;然后考察了pH、微生物的培养时间及培养温度等实验条件对FMtox的影响;最后在优化的实验条件(E.coli,37℃,60min,pH=7.0)下,将自制的灵敏微电极阵列(ultramicroelectrode array,UMEA)与FMtox相结合,详细研究了不同类型的化学品对E.coli的毒性。结果表明,FMtox可以灵敏的检测标准毒物3,5-二氯苯酚(DCP)、CN及As2O3的毒性,其半数抑制浓度(50% inhibitingconcentration,IC50)分别为8.0mg/L、4.9mg/L和18.3mg/L。但由于受到FMtox体系内的一些诸如PO43-、CN-及OH-等因素的影响,游离态的重金属离子的浓度大幅度降低,因此该体系对重金属的毒性反应较为迟钝。
第四章首先以不同的微生物作为受试体,详细地考察了它们对DCP毒性的灵敏程度;然后在第三章的基础上继续优化FMtox体系的检测条件;最后将最优状态下的FMtox应用于环境污染物苯酚及其硝基取代物(n-NP,n代表硝基的位置)的毒性实验。结果表明,在受试微生物中Pseucomonas fluorescens(P.fluorescens)对DCP的毒性最灵敏;标准的葡萄糖-谷氨酸(glucose-glutamic acid,GGA)溶液的存在可以有效增加微生物的灵敏度;4h的饥饿培养不仅对微生物的灵敏度无明显影响,还会大幅度降低其活性。因此,FMtox最终选定不经前处理的P.fluorescens作为模型微生物,培养时间为60min,温度为30℃。采用本体系测得的4-NP对P.fluorescens的IC50为14.0mg/L,与标准MicrotoxR的结果相一致。同时,实验结果确定的苯酚及NP的毒性排序为4-NP>2-NP>3-NP>苯酚。该顺序与MicrotoxR及小鼠的毒性排序基本一致。最后,本章对苯酚和n-NP混合物的毒性进行了详细的考察,其结果显示为:FMtox对苯酚和4-NP、2-NP和4-NP的二元混合物及苯酚、2-NP和4-NP的三元混合物的毒性均有灵敏响应,相对应的IC50分别为16.1mg/L、36.1mg/L、10.3mg/L:其联合毒性作用类型分别为加合型、加合型及协同型。但是FMtox对苯酚及苯酚和2-NP的二元混合物的毒性响应迟钝,其IC50分别为291.4mg/L、280.8mg/L;其二元混合物的联合毒性作用类型为拮抗型。确定的影响因素除了待测毒物的自身性质及所采用体系的差异以外,还包括了苯酚类物质对电极的污染及磷酸缓冲溶液对n-NP的化学性质的影响。