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戊型肝炎(hepatitis E, HE)是继甲型肝炎外另一种经肠道传播的严重危害人类健康的病毒性肝炎。戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)是其病原体,为单股正链RNA病毒。明确HEV的基因型对于戊型肝炎的诊断、预防及流行病学具有重要意义。目前,HEV基因分型尚无统一标准,存在很多问题与分歧。由于全基因组测序费时费力,大多数研究者通过测定HEV基因组部分序列进行基因分型,而用于分型的基因组区段至今还未达成统一,给各HEV基因分型研究结果的比较造成很大困难。其次,HEV基因分型采用的标准不尽相同。部分学者以核苷酸同源性低于20%为标准,而有些以15%为标准,还有部分学者以遗传距离作为基因分型标准。随着更多的HEV毒株的分离测序,标准的不确定性严重影响了HEV的基因分型结果,尤其基因亚型的判别更为困难。此外,HEV基因分型的命名方法也存在混乱之处,罗马数字与阿拉伯数字混用,同一分离株被命名为不同基因型。针对HEV基因分型的现状,本研究通过设计通用性引物,尝试利用逆转录-巢式聚合酶链反应(RT-PCR)扩增各基因型HEV基因组部分序列,并与文献已报道的通用性引物扩增的PCR片段比较,筛选最适的HEV基因组区段以替代全序列进行HEV基因分型,从而统一用于HEV基因分型的基因组区段。同时利用全基因序列计算所得数据,建立用于HEV基因分型的基因同源性及遗传距离的标准,并在基因分型的同时提出统一的命名规则,使HEV基因分型进一步标准化。本研究实验内容主要包括以下两部分:基于不同基因组区段进行HEV基因分型根据GenBank中已登录的37株不同基因型HEV全序列,在HEV序列保守区设计MJ-A、MJ-B、MJ-C、MJ-D 4组引物,同时检索文献找出其它已有报道的20组通用性引物。通过两因素及单因素统计学方法,分析基于24组引物扩增区段的基因同源性和遗传距离数据与基于全序列的数据在不同基因型及同一基因型内有无差异,找出与全序列无统计学意义的区段;比较基于该区段及基于基因组全序列进行的系统进化分析结果,进一步证明该区段可替代全序列用于基因分型。依据全序列计算所得的遗传距离、基因同源性,建立HEV的分型标准,以系统进化分析验证。研究结果表明,以基因同源性为统计数据,利用Dunnett-t及SNK-q两种统计学方法,在两因素及单因素方差分析中,仅有位于HEV RNA多聚酶功能域的MJ-C组引物PCR扩增区段与全序列分析数据无统计学差异,可在不同基因型间及同一基因型内均可替代全序列进行基因分型;以遗传距离为统计数据,引物GV-A扩增区段可替代全序列进行基因分型,但无法替代I型内部HEV的分型。以37株全基因组HEV统计数据为参照,现有HEV基因型及亚型分型标准分别为:基因型间遗传距离大于0.30,核苷酸差异大于24%;基因亚型间遗传距离大于0.11,核苷酸差异大于10%。按照这一标准,结合系统进化分析,37株HEV分为I~IV基因型及若干亚型。基于MJ-C扩增区段的基因分型结果与全序列分型完全一致。二、通用性引物RT-PCR扩增不同基因型HEV 用筛选得到的最适引物MJ-C进行RT-PCR扩增I~IV型HEV标准株,检测其通用性,并用于HEV IgM阳性的临床标本RT-PCR检测及基因分型。结果显示MJ-C可以扩增各型HEV标准株;38份临床标本,13份测出特异性HEV RNA,阳性率35%。13份样本均为IV型HEV,进一步可分为4种基因亚型。<WP=5>综上,本研究通过生物信息学及统计学方法分析,成功筛选出位于HEV RNA多聚酶功能域的基因组区段(4254~4560nt)可以替代HEV基因组全序列进行基因分型,该区段侧翼序列保守,可用于扩增不同基因型HEV;同时基于全基因组序列分析,建立HEV基因分型标准为基因型间遗传距离大于0.30,核苷酸差异大于24%;基因亚型间遗传距离大于0.11,核苷酸差异大于10%;此外,本研究首次明确提出HEV基因型的系统命名法:以罗马数字和26个英文小写字母分别作为基因型及基因亚型序号,以毒株分离时间先后作为命名顺序。上述标准的建立,必将解决HEV基因分型中的众多分歧,进一步完善与促进HEV基因分型的研究。