研究背景肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是威胁人类健康的常见肿瘤之一,据统计近年来以2.5%的年均增长率稳步递增,RCC约占成人全身恶性肿瘤的3%,是泌尿系统最致命的癌症,最终致死率超过40%,而这一比例在前列腺癌和膀胱癌中仅约20%。约20%-30%的患者将出现转移,临床局限性肾癌行肾切除术后约20%～40%会发生转移。近年来由于超声等影像检查的应用,肾癌早期诊断率上升,可能提高肾癌患者的预后。肾癌的发生率在过去50年中持续增长,年均死亡率上升至36.5%。过去20年在肾细胞癌患者诊断、分期和治疗的显著进步,提高了患者的生存率,改变了肾细胞癌的自然病程。尽管在转移性肾癌患者生物治疗和免疫治疗有效率仍然只有15-25%。近来在肾癌发病机制、肿瘤行为和分子生物学方面的研究为早期诊断肾癌、更好地预测肿瘤预后以及提高肾癌细胞患者的生存率提供了可能。大量的基因、细胞遗传学、免疫组织化学的分析和/或蛋白质组学方法,生物标记,让临床医生早期发现肾癌,为患者疾病的结果提供预后信息,不过至今在肾细胞方面仍未发现特别有效的治疗方法。肾癌的早期发现和诊断困难,延误诊断主要是因为其缺乏典型的临床表现,和泌尿系统其他肿瘤相比,肾细胞癌发生转移的可能性更大,转移性肾癌是临床治疗的一大挑战,因为其对放射治疗和化学治疗均不敏感。近年来新的络氨酸激酶抑制剂舒尼替尼和索拉非尼已用于临床,初步取得了令人满意的效果,实验证明其抗肿瘤的机制之一是与肿瘤患者体内的髓源抑制性细胞(myeloid derived suppressor cells, MDSCs)有关,其能单独降低或是联合其他药物降低患者体内MDSCs的水平,从而改善患者的免疫抑制。有不少研究报道了一群抑制性的细胞群体-MDSCs,在动物模型、肿瘤患者的外周血、淋巴器官、骨髓和肿瘤部位都发现了其存在,在小鼠,MDSCs公认的表型为Gr-1+CD11b+,根据其与Gr-1分子中不同表位(Ly6G、Ly6C)的抗体结合特异性不同分为两个亚群：单核细胞样的MDSCs亚群CD11b+Ly6G2-Ly6Chigh (Gr-1low)(即Mo-MDSCs),和粒细胞样的MDSC亚群CD11b+Ly6G+Ly6Clow(Gr-1high)(即PMN-MDSCs)。在人类,MDSCs上无公认的表型,通常认为其可分为CD14+单核系MDSCs或CD15+粒系MDSCs,同样表达共同的髓系标志CD11b和CD33但是缺乏HLADR和其他成熟的淋巴细胞表面标记CD3/CD19/CD56.人类不同类型的肿瘤可能诱导不同的MDSCs亚型,新近报道,在非小细胞肺癌患者中存在表型标记为CDllb+CD14-CD15+HLADR-的粒系MDSCs.单核系CD14+CD11b+HLADR-/low MDSCs被发现存在在恶性黑色素瘤、肝细胞癌和卵巢癌,提示不同的肿瘤患者中,其MDSCs的表型可能不同。这群细胞曾经被称为自然抑制细胞、未成熟髓细胞(IMC)、髓系抑制细胞(MSC),虽然这种命名反应了他的生物学功能,但是易和间充质干细胞(MSC)混淆,不利于研究,于是2007年该领域的学者建议将其命名为MDSCs.在恶性肿瘤的发生和发展过程中,MDSCs被认为是一个关键的免疫抑制细胞,其免疫抑制能力已经在多种恶性肿瘤中报道,如头颈部肿瘤、前列腺癌、乳腺癌等。且有证据表面其在外周血中的水平与疾病的进展程度和肿瘤分期有关,其通过抑制肿瘤的免疫促进肿瘤的生长。还有研究证明MDSCs能促进血管的生成和肿瘤的转移。此外,除了肿瘤,感染、创伤、自身免疫性疾病等病理状态下MDSCs的水平会升高。在有关于MDSCs和肿瘤的相关研究中,Gabitass, R. F等证明外周血MDSCs在胰腺癌(46例)、食道癌(60例)和胃癌(25例)是显著升高的,且与临床分期有关。MDSCs增加的比例和死亡增加的风险相关,在多变量分析中,MDSCs的水平是一个独立的预后因素,MDSCs的比例每增加一个单位,死亡风险将增加22%,(HR1.22,95%可信区间1.06-1.41)。研究目的尽管在动物模型中有一些研究MDSCs的表型和功能,但是关于MDSCs在人类肿瘤中的作用研究还偏少,且主要涉及基础性研究,与临床相关的研究更少,本研究与临床联系较为紧密。根据以往资料我们选择CD33+HLA-DR-作为MDSCs的表型,对比其在肾癌患者和健康志愿者外周血单个核细胞中的水平变化,探讨其与肾癌的临床分期和病理特征的相关性,以及术前和术后一月其在外周血中的变化情况,考虑其作为临床判断预后和指导治疗的指标可能性,通过检测其水平将有助于早期诊断和早期治疗肾癌患者,协助减少一些对患者不必要的治疗和检查,为进一步阐明肾癌发生机制和寻找新的治疗靶点提供理论基础和实验依据。材料和方法标本取自2011年6月至2012年10月在珠江医院泌尿外科接受治疗的肾癌患者,共44例,入组患者均符合肾癌的CT和病理组织学诊断标准,年龄23-78岁,中位年龄51岁,其中男性患者27例,女性患者17例,50岁以上30例,50岁以下14例。入院前未行其他治疗(放疗、化疗、免疫治疗等),因血尿或体检发现,无合并其他系统肿瘤,近期没有外伤和感染性疾病及自身免疫性疾病。按照肾癌临床的分期标准(2002年AJCC),其中Ⅰ期+Ⅱ期20例、Ⅲ期11例、Ⅳ期13例；根据术后患者肾癌标本的病理诊断,肾透明细胞癌(20例),乳头状腺癌(8例),嫌色细胞癌(9例),其他病理诊断如髓样癌、嗜酸细胞腺瘤等共7例。另外选择选择年龄、性别和与肾癌患者组相匹配的健康志愿者18人(健康对照组),年龄25～72岁,中位年龄49岁,既往无肿瘤等相关疾病,近期无外伤、感染性疾病及自身免疫性疾病。留取两组人员术前外周血及术后一月外周血,术后肿瘤组织标本及正常肾组织(据肿瘤边缘5公分以上)取得后立即置入液氮罐中保存,后转入实验室-80°冰箱内保存,另取一份标本用甲醛固定,石蜡包埋。入组人员均签署知情同意书,并获得本单位伦理委员会批准。采集肾癌患者外周血约2m1,乙二胺四乙酸抗凝。抗凝血2m1以等容积RPMI稀释,沿试管避缓缓加入4～5m1人血淋巴细胞分离液,2000r/min,离心20min,吸管吸取上层和中层之间单个核细胞层,冲洗2次,均以1500r/min,离心10min,弃上清液,RPMI液稀释,计数调整浓度至106个/m1。取上述细胞液1001μl至流式管,加入APC-HLA-DR抗体和FITC-CD33抗体,4℃孵育30min后,PBS冲洗,离心去上清液,加入多聚甲醛固定,24h内上流式细胞仪分析。通过CD33和HLA-DR双重标记健康志愿者和肾癌患者外周血,利用流式细胞计数仪分析计数10000个细胞中表达CD33+HLA-DR-的MDSCs所占的比例,并分析其与临床病理因素的相关性。采集健康志愿者外周血约2m1,后续以同样方法检测。研究结果(1)肾癌患者外周血和健康志愿者外周血中均存在CD33+HLA-DR-MDSCs,但在肾癌患者外周血单个核细胞中所占的比例明显高于在健康志愿者外周血单个核细胞中的比例[(1.91±0.66)%：(0.62±0.22)%,P<0.001],在肿瘤组织中同样存在和正常肾组织中存在同样的变化。(2)在不同分期的肾癌患者外周血单核细胞中,CD33+HLA-DR-MDSCs的表达有所不同；临床分期中为晚期的患者CD33+HLA-DR-MDSCs的比例明显高于早期的患者,Ⅰ+Ⅱ期：Ⅲ期[(1.46±0.44)%：(2.04±0.35)%,P<0.01]；Ⅲ期：Ⅳ期[(2.04±0.35)%：(2.50±0.64)%,P<0.05]；肾癌外周血CD33+HLA-DR-MDSCs表达与肿瘤进展及肿瘤分期成正相关(p<0.05),外周血中CD33+HLA-DR-MDSCs的水平与淋巴结及远处转移呈正相关,有转移的患者外周血中的水平明显要高于无转移的患者,[(2.48±0.39)%：(1.59±0.46)%,(P<0.001)],术后根据患者肾癌标本的病理诊断,本实验测得三种病理类型即肾透明细胞癌(CCRCC)、乳头状腺癌(PRCC)和嫌色细胞癌(CRCC)的患者外周血单个核细胞中CD33+HLA-DR-MDSCs水平分别为:(2.30±0.13)%、(1.52±0.21)%、(1.76±0.20)%；透明细胞癌患者外周血单个核细胞中CD33+HLA-DR-MDSCs水平高于乳头状腺癌及嫌色细胞癌患者(P<0.01)；但是乳头状腺癌与嫌色细胞癌患者其水平相差不大(P>0.05)。(3)而在肿瘤直径大于7和小于等于7的患者中则差异不明显,[(2.08±0.60)%：(1.70±0.55)%(P<0.05)]。进一步的研究证明肾癌患者外周血中CD33+HLA-DR-MDSCs的水平与肿瘤的分化程度差异小,无统计学意义[(2.09±0.59)%：(1.70±0.56)%(P>0.05)]。在患者性别和年龄(大于等于50岁与小于50岁)方面,外周血中CD33+HLA-DR-MDSCs的水平的差异同样缺乏统计学意义,男(27例)：女(17例)[(1.84±0.54)%：(2.03±0.81)%(P>0.05)],在50岁以上(30例)和50岁以下(14例)患者中为[(1.86±0.52)%：(2.03±0.89)%(P>0.05)]。研究结论(1)在肾细胞癌患者和健康志愿者外周血单个核细胞中可见CD33+HLA-DR-MDSCs表达,在肾癌患者中表达高于健康志愿者,对于肾癌的发生和发展起着重要作用,其水平与肾癌的临床分期和淋巴结及远处转移相关,且可能与肾癌的预后及肿瘤免疫相关。(2)在血液中和肿瘤组织中均存在的CD33+HLA-DR-MDSCs为我们提供了一个针对肿瘤免疫治疗的新策略,在将来的临床实验中可以更多的研究相关药物及其余治疗方法对MDSCs的影响。