研究背景与目的：真核细胞内蛋白的降解主要有两种途径,一种通过蛋白酶体被降解即泛素-蛋白酶体途径,另一种是通过自噬途径。这两种途径负责细胞内蛋白的降解和利用,任何一种途径出现障碍,均可导致机体的病变,而这两种途径的上调则可显示某些疾病的改善。足细胞是一种高度分化的细胞,具有复杂而精细的细胞结构,并在多种肾脏疾病的发展过程中起着重要的作用。足细胞的受损和丢失通常是许多肾脏疾病进展及导致肾衰竭的关键因素。作为构成肾小球滤过屏障最重要成分的足细胞经常容易暴露在毒素、免疫、代谢等多种有害因素下,这些有害因素往往引起细胞出现氧化应激反应以及DNA的损害,最终导致细胞产生自噬以清除有害成分或出现细胞凋亡。糖尿病肾病是一种常见的足细胞病,细胞内氧化应激反应增强是糖尿病肾病的重要致病因素,而氧化应激反应是导致自噬活性增强的重要机制。因此,有理由认为高糖刺激可以引起足细胞自噬活性的改变；雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤(3-MA)是常见的特异性自噬调节剂,但这些自噬调节剂对于高糖刺激足细胞后自噬变化的调节作用尚不明确；高糖刺激足细胞后,细胞既可能通过自噬清除废弃的蛋白和细胞器,也可能出现细胞凋亡,在不同时期,自噬和凋亡的活性可能出现变化。本研究通过糖尿病大鼠模型及体外足细胞培养,观察高糖刺激对足细胞自噬的影响；通过自噬调节剂对高糖培养的足细胞的作用,观察自噬调节剂对足细胞自噬的影响；通过活性氧及相关蛋白的检测,分析高糖影响足细胞自噬的机理；通过观察不同时期自噬及凋亡的变化,进一步探讨自噬与凋亡的关系。方法：第一部分：16只170-200g SD大鼠,随机分为对照组及糖尿病组,其中糖尿病组大鼠给予单剂量链脲佐菌素(STZ)65mg/kg腹腔注射一次,对照组则给予等量安慰剂腹腔注射。STZ腹腔注射后48小时,经大鼠尾静脉检测血糖,大鼠血糖超过16.7mmol/L则认为糖尿病大鼠模型成功。于造模后8周收集24小时尿液,测定尿白蛋白含量;于造模成功后8周处死动物,收集血标本和肾组织标本,检测左肾重/体重、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、糖化血红蛋白(HbA1c),透射电镜观察足细胞内自噬体改变。第二部分：体外培养永生化小鼠足细胞,随机分为普通糖对照组(葡萄糖5mmol/L)及高糖组(葡萄糖30mmol/L),收集两组细胞,透射电镜观察足细胞内自噬体改变。GFP-LC3转染及MDC染色后经荧光显微镜检测足细胞内自噬体,Western-blot检测两组足细胞LC3-2及Beclin-1。第三部分：体外培养永生化小鼠足细胞,随机分为普通糖对照组、高糖组、H202培养组,Western-blot检测各组足细胞LC3-2。体外培养永生化小鼠足细胞,随机分为普通糖对照组、高糖组、普通糖+NAC组、高糖+NAC组,收集各组细胞,吖啶橙染色后经共聚焦显微镜检测足细胞内自噬体；Western-blot检测各组足细胞LC3-2及Beclin-1。体外培养永生化小鼠足细胞,随机分为普通糖对照组及高糖组,经共聚焦显微镜检测两组细胞1小时内ROS值；Western-blot检测两组足细胞Catalase和MnSOD。第四部分：体外培养永生化小鼠足细胞,随机分为普通糖对照组、高糖组、普通糖+雷帕霉素组、高糖+雷帕霉素组,收集各组细胞,吖啶橙染色后经共聚焦显微镜检测足细胞内自噬体；Western-blot检测各组足细胞LC3-2及Beclin-1.体外培养永生化小鼠足细胞,随机分为普通糖对照组、高糖组、普通糖+3-MA组、高糖+3-MA组,收集各组细胞,吖啶橙染色后经共聚焦显微镜检测足细胞内自噬体；Western-blot检测各组足细胞LC3-2及Beclin-1。第五部分：体外培养永生化小鼠足细胞,经高糖培养后,根据培养时间分为12h、24h、48h及72h组,检测各组Beclin-1及流式细胞仪评价各组足细胞凋亡率。体外培养永生化小鼠足细胞,经高糖+雷帕霉素培养后,根据培养时间分为12h、24h、48h及72h组,流式细胞仪评价各组足细胞凋亡率。体外培养永生化小鼠足细胞,经高糖+3-MA培养后,根据培养时间分为12h、24h、48h及72h组,流式细胞仪评价各组足细胞凋亡率。结果：第一部分：糖尿病大鼠肾小球足细胞自噬活性明显增加。第二部分：高糖增加了培养足细胞的自噬活性。第三部分：NAC可抑制高糖刺激的足细胞自噬活性,高糖增加了足细胞产生ROS(?)Catalase与MnSOD表达。第四部分：雷帕霉素可进一步增强高糖所诱导的足细胞自噬,3-MA则可抑制高糖所致的足细胞自噬。第五部分：高糖刺激的足细胞,自噬活性在24h最强,以后逐渐减弱；而高糖刺激后足细胞凋亡逐渐增加,至72h时达高峰。雷帕霉素可抑制高糖刺激的足细胞凋亡；而3-MA则可促进高糖刺激的足细胞凋亡。结论：高糖可刺激足细胞自噬活性增强；自噬调节剂可调节高糖所致的足细胞自噬活性；高糖可能通过ROS产生刺激足细胞自噬活性；高糖既可刺激足细胞自噬,也可引起足细胞凋亡,自噬在早期表现明显,而凋亡则在晚期明显增加；自噬调节剂可影响高糖所致足细胞凋亡。