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研究背景:生物信息学分析表明乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）中存在与Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂高度同源的“Kunitz结构域”,该结构对其功能至关重要。HBx与丝氨酸蛋白酶的抑制因子竞争结合肝细胞来源的丝氨酸蛋白酶,扰乱细胞内转录因子的水解途径,而行使其反式激活功能。蛋白酶体为普遍存在于真核生物、古菌、原核生物中的一类蛋白质复合物。在真核生物中,蛋白酶体位于细胞核和细胞质中。蛋白酶体是细胞用来调控特定蛋白质和除去错误折叠蛋白质的主要机制。蛋白酶体降解途径对于许多细胞进程,包括细胞周期、基因表达的调控、氧化应激反应等,都是必不可少的。细胞周期进程是由一系列细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）来进行调控的,而CDK则是由细胞周期蛋白（cyclin）来激活。有丝分裂的细胞周期蛋白是所有已知的细胞内蛋白中寿命最短的。在CDK-cyclin复合物行使了它的功能之后,复合物中的cyclin就会被多泛素化并由蛋白酶体降解,从而保证了细胞周期的正常运转。细胞内外的信号都能够诱导细胞凋亡或程序化细胞死亡,细胞内部的组分发生解构,这一过程主要是由特定的蛋白酶半胱天冬酶（caspase）来完成,但同时蛋白酶体在细胞凋亡过程中行使多种重要的作用。蛋白酶体的抑制作用可以影响不同类型细胞的调亡诱导,在大多数研究的细胞中,抑制蛋白酶体可以促进细胞调亡。蛋白酶体抑制剂对于体外培养的细胞具有有效的抗肿瘤活性,通过降解受调控的促生长细胞周期蛋白来诱导肿瘤细胞的凋亡。因此一些蛋白酶抑制剂已被开发应用于临床的肿瘤治疗。研究目的:本研究合成与HBx的Kunitz结构域序列相同的一肽段（PKD）,探讨其是否通过抑制蛋白酶体的活性、调控与蛋白酶体降解通路相关的VCP、细胞周期素和细胞周期素依赖性蛋白激酶等蛋白的表达,并由此对HepG2细胞的细胞周期、细胞凋亡和放射敏感性产生影响。研究方法:利用蛋白质分析软件Vector NTI 6.0对HBx同源性进行分析,设计合成PKD的序列。利用固相多肽合成技术化学合成与HBx羧基端九个氨基酸序列完全一致的肽段Phe-Val-Leu-Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys,探讨其对HepG2细胞的作用。通过高压液相色谱法（HPLC）和质谱对纯化后PKD再进行鉴定。用MTT方法检测PKD对HepG2细胞生长的影响;采用比色分析法检测蛋白酶体的ATP酶活性;通过分析对不同肽酶特异性荧光肽底物LLE-NA,LLVY-AMC和LSTR-AMC的水解,分析蛋白酶体的类胰凝乳蛋白酶、类胰蛋白酶和肽谷氨酰基肽水解酶活性;利用AlignX软件对GenBank中VCP的同源性进行分析,利用DNAStar 7软件分析VCP序列的特点,根据对其亲水性结构、柔韧区、抗原指数及表面概率结构参数综合分析,选择人类VCP的637～647位和689～696位两段序列,设计用于制备VCP抗体的19个氨基酸融合肽的序列GRLDQLIYIPLEICQRACK。利用固相多肽技术合成VCP融合肽,将其与载体蛋白KLH偶联形成VCP-KLH。利用常规免疫方案用VCP-KLH免疫BALB/c小鼠,制备VCP的多克隆抗体,再通过ELISA技术检测其效价。利用实验所制备的鼠抗VCP抗体,进行Western蛋白印迹,检测VCP的表达。通过免疫组织化学法检测HepG2细胞中P27,Cyclin E,Bax,Bcl-2,Fas和Caspase-8的表达。利用利用荧光素（FITC）标记的凋亡相关蛋白TFAR19单克隆抗体,对HepG2细胞进行标记,观察PKD对HepG2细胞诱导细胞凋亡的形态学变化。流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的改变。通过细胞照射及克隆形成实验观察PKD对HepG2细胞放射敏感性的影响。研究结果:合成的PKD肽Phe-Val-Leu-Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys纯化后,经HPLC检测纯度＞97%,质谱鉴定合成PKD的氨基酸组成和序列正确。MTT方法检测0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L和15mmol/L的PKD对HepG2细胞生长的影响,结果显示HepG2细胞的活力随PKD剂量增加呈现出降低的趋势,15mmol/L的PKD有明显的细胞毒性。通过分析对不同肽酶特异性荧光肽底物LLE-NA,LLVY-AMC和LSTR-AMC的水解,实验发现在HepG2细胞中10mmol/L的PKD可显著地抑制蛋白酶体的糜蛋白酶样活性（p＜0.05）,但对其胰蛋白酶样和肽-谷氨酰肽样酶活性较糜蛋白酶样活性相比抑制作用弱。此外进一步观察随时间的变化,PKD对蛋白酶体的糜蛋白酶样活性影响的反应动力学改变。PKD未作用的蛋白酶体的糜蛋白酶样活性在12分钟左右,反应趋于高峰并渐趋平坦。10mmol/L的PKD则使蛋白酶体的糜蛋白酶样活性一直处于抑制状态。蛋白酶体的ATP酶活性为2.5h时限,利用抗蛋白酶体的抗体和偶联有蛋白G琼脂糖微球对蛋白酶体复合体进行免疫共沉淀。10mmol/L的PKD处理的HepG2细胞与未经PKD处理的相比较,PKD显著地抑制蛋白酶体复合体的ATP酶活性。用ELISA法测定VCP融合肽抗血清的效价为1:10000。10mmol/L的PKD作用HepG2细胞36h后,收集细胞裂解,提取蛋白进行Western蛋白印迹,分析VCP的表达。对于相同蛋白浓度的样品,与未用PKD处理的HepG2细胞相比,PKD处理的HepG2细胞的Western蛋白印迹可见条带（97kDa）的密度明显减弱,表明PKD较明显地抑制VCP的表达。免疫组织化学法检测HepG2细胞中P27,Cyclin E,Bax,Bcl-2,Fas和Caspase-8的表达,结果显示经10mmol/L的PKD作用于HepG2人肝癌细胞株后,P27蛋白的水平明显升高,与空白对照组比较均有显著性改变。PKD作用后的HepG2细胞中p27以胞核及核周出现棕黄色。PKD未作用的HepG2细胞没有明显的阳性着色。PKD上调P27在HepG2细胞中的表达。PKD合成肽处理的HepG2中大多数细胞Cyclin E染色呈现阴性,其胞核不着色,细胞浆和细胞膜呈蓝色。未经PKD干预的HepG2其Cyclin E蛋白表达明显,主要分布于核周围的胞浆和细胞核内,呈均匀的棕黄色细颗粒状。PKD抑制HepG2细胞中周期蛋白质Cyclin E的表达。10mmol/L的PKD可明显促进HepG2细胞中Bax的表达,Bax蛋白呈深黄色染色、弥漫性或局限性分布于细胞浆,胞核蓝染。空白对照的HepG2细胞呈阴性。PKD促进HepG2细胞中Bax蛋白的表达。HepG2细胞均为Bcl-2阳性着色细胞,Bcl-2棕黄色颗粒状,主要定位于胞浆中。10mmol/L的PKD可完全抑制Bcl-2的表达,PKD处理后的HepG2细胞未见阳性染色。PKD抑制HepG2细胞中Bcl-2蛋白的过表达。HepG2细胞未出现明显的阳性染色,但当10mmol/L的PKD作用HepG2细胞后,阳性表达的Fas反应物为棕黄色颗粒,分部于胞浆和胞膜。PKD提高HepG2细胞中Fas蛋白的表达。与空白对照组的HepG2细胞相比较,10mmol/L的PKD可明显增加HepG2细胞中Caspase-8的表达,Caspase-8蛋白呈深黄色染色分散于胞浆和胞核。PKD诱导HepG2细胞中Caspase-8的表达。本研究证实P27,Bax,Fas和Caspase-8在10mmol/L PKD作用的HepG2细胞中表达明显增高,但是cyclin E与Bcl-2的表达降低。10mmol/L PKD作用HepG2细胞36小时可致使细胞滞留于G0-G1期,并产生明显的细胞凋亡,未处理的细胞则大部分进入S期。利用荧光素（FITC）标记的单克隆抗体为探针,示踪一新的凋亡相关分子TFAR19,PKD作用的HepG2细胞出现典型细胞凋亡的形态学改变。5mmol/L PKD干预和空白对照组细胞在接受不同剂量的照射后,克隆形成实验结果经Sigma Plot11软件以多靶单击模型SF=1-(1-e-D/D0)n拟合细胞存活曲线,并计算细胞的放射敏感性参数。5mmol/LPKD增加HepG2细胞的放射敏感性30%(SERD0=1.34、SERDq=1.24、SERSF2=1.29)。结论:本研究结果表明PKD为一种源于乙型肝炎病毒x蛋白的Kunitz结构域的潜在蛋白酶体抑制剂,它通过抑制蛋白酶体的糜蛋白酶样活性和降低其ATP酶活性,下调p97、cyclin E与Bcl-2的表达、上调P27,Bax,Fas和Caspase-8的表达,引起HepG2细胞的生长停滞和促进细胞凋亡,增加对HepG2细胞的放射敏感性。