论文部分内容阅读
中药知母（Anemarrhenae Rhizoma）为百合科植物知母的干燥根茎,是一种已被收录在《中国药典》中的具有清热泻火,滋阴润燥等作用的著名传统中草药。知母主要含一系列皂苷和黄酮类成分。现代药理学研究表明,它具有抗肿瘤、抗炎、解热、抗糖尿病、抗抑郁、抗血小板聚集和抗衰老、改善学习记忆等多种活性。知母及其提取物能显著改善AD模型动物的学习和记忆能力,具有与治疗AD相关的胆碱酯酶的抑制活性;此外,它还能通过增强胆碱能神经元的功能来减少A?的沉积,改善因长期胆碱能退变而造成的记忆缺陷。因此,知母常出现在临床治疗AD的处方中。然而,知母治疗AD的机制尚未明确,其活性成分跨器官屏障转运的情况也尚且未知。因此,本文围绕知母多种活性成分进行了以下三个方面的研究:1、基于体外Caco-2细胞模型的知母多成分跨膜转运研究目的:探讨知母多成分跨肠道转运机制,阐明知母成分与转运蛋白间的关系。方法:利用Caco-2细胞建立单层细胞肠道吸收模型,并对其结构和功能进行评价。选择合适浓度的知母多成分即知母皂苷AIII、知母皂苷BII、芒果苷、异芒果苷、新芒果苷、宝藿苷I、菝葜皂苷元进行跨膜转运实验,通过所建立的知母7种成分高效液相色谱串联三重四级杆质谱（HPLC-QQQ/MS）定量方法检测上述多成分在细胞转运样品中的含量,从而分析各目标成分跨肠吸收屏障的转运情况。结果:采用Caco-2细胞建立肠吸收屏障模型的单层细胞膜电阻值TEER为552Ω·cm2,荧光素钠的渗透系数为（0.28±0.04）×10-6 cm/s;P-gp抑制剂酮康唑可以抑制罗丹明123在该模型中的外排,增加罗丹明123在该模型中的吸收。所建立的HPLC-QQQ/MS检测方法,专属性好,准确度和精密度均符合要求;跨膜转运结果表明,芒果苷、异芒果苷、新芒果苷、宝藿苷I、知母皂苷AIII、知母皂苷BII和菝葜皂苷元的Papp（AP-BL）分别为（8.524±1.706）×10-8、（40.758±5.872）×10-8、（102.807±17.238）×10-8、（18.884±1.587）×10-8、（44.087±1.413）×10-8、（10.041±0.791）×10-8和（32.018±4.633）×10-8cm/s,其中异芒果苷、宝藿苷I、知母皂苷BII、菝葜皂苷元的外排率（ER）大于2,7种活性化合物分别与酮康唑配伍作用后,外排率（ER）均显著降低。结论:中药知母的活性成分异芒果苷、宝藿苷I、知母皂苷BII、菝葜皂苷元为P糖蛋白底物,芒果苷、新芒果苷、知母皂苷AIII在Caco-2细胞模型上的吸收可能为单纯的透细胞被动转运,其中新芒果苷吸收良好且不受P-gp抑制剂的影响。2、大鼠体内知母提取物多成分的药代动力学及P-糖蛋白对其影响的研究目的:探讨知母多成分在动物体内药代动力学特征以及P-糖蛋白对各成分体内过程的影响。方法:建立血浆中知母多成分的HPLC-QQQ/MS定量方法,采用蛋白沉淀法处理血浆样品,梯度洗脱,流速为0.300 m L/min,采用质谱多反应监测模式进行定量分析。16只大鼠随机均分为对照组和抑制剂组,抑制剂组大鼠口服灌胃酮康唑溶液（10 mg/kg,1 m L/200 g）,对照组大鼠口服灌胃生理盐水（1 m L/200g）,30分钟后,所有大鼠均灌胃知母提取物（60 g/kg,2 m L/200 g）。分别在灌胃知母提取液0.25 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12h、24 h、30 h、36 h后,按照给药顺序各收集8只对照组、8只抑制剂组大鼠的血样。通过测定血浆样品中知母各成分浓度,拟合其药代动力学参数,并评价P-gp抑制剂酮康唑对知母成分体内过程的影响。结果:血浆中HPLC-QQQ/MS方法7个成分的专属性良好,日内和日间精密度RSD均小于11%,基质效应为87.06-123.85%,稳定性符合要求;对照组大鼠血浆中能检测到除宝藿苷I外的其他6种成分,与对照组相比,抑制剂组大鼠血浆中能检测到包括宝藿苷I在内的全部7种成分;芒果苷和异芒果苷在大鼠体内吸收良好,AUC和Cmax值均较高;菝葜皂苷元的半衰期和消除时间在7种成分中最长,且在加入P-糖蛋白抑制剂酮康唑后其Tmax值显著延长。结论:芒果苷、异芒果苷和新芒果苷在大鼠体内吸收良好;知母皂苷BII吸收较好且为P-糖蛋白底物;知母皂苷AIII在大鼠体内吸收一般但消除时间较长;宝藿苷I为P-糖蛋白底物且口服给药生物利用度极低;菝葜皂苷元的跨肠道屏障受P-糖蛋白影响,推测也可能为P-糖蛋白底物。3、知母提取物多成分在大鼠脑部的分布研究目的:探讨知母多成分在动物体内跨血脑屏障转运至脑部分布情况。方法:通过给予正常SD大鼠灌胃知母提取液,按照60 g/kg（2 m L/200 g）的给药剂量对大鼠灌胃知母提取液后,于1 h、3 h、6 h、9 h以及24 h分别测定大鼠血浆和脑组织中知母成分的浓度,分析知母多成分跨BBB转运情况。结果:建立了脑组织中知母7种成分的HPLC-QQQ/MS定量方法,专属性、精密度和准确度、基质效应、稳定性符合要求。新芒果苷、知母皂苷BII、知母皂苷AIII和菝葜皂苷元可跨BBB向脑部转运,而芒果苷、异芒果苷跨BBB向脑组织转运量极少;与此同时,宝藿苷I在血液中无法检出,也不能跨BBB向脑组织转运;新芒果苷、知母皂苷BII和菝葜皂苷元在不同时间点的脑血比值不断上升,其中新芒果苷和菝葜皂苷元能迅速经血液吸收入脑,同时菝葜皂苷元在24 h时脑/血比达到147%,说明菝葜皂苷元能跨BBB屏障向脑部转运且吸收良好,而知母皂苷BII在9 h前脑血比值较小,24 h时增加了近十倍,说明其在脑部的药物代谢明显慢于血液中,推测其受P-糖蛋白的外排作用影响较大;而知母皂苷AIII的脑血比值在不同时间点没有显著性变化,说明其在脑部和血液中的消除速率基本一致。结论:新芒果苷、知母皂苷BII、知母皂苷AIII和菝葜皂苷元可跨BBB向脑部的转运,其中新芒果苷和菝葜皂苷元在脑部的吸收较快,菝葜皂苷元在脑部的消除速率明显低于血液中,知母皂苷BII跨BBB向脑部转运受P-糖蛋白外排作用的影响较大。综上所述,知母中异芒果苷、宝藿苷I、知母皂苷BII和菝葜皂苷元可能为P-糖蛋白底物;芒果苷和异芒果苷经口服给药后能迅速吸收入血,且生物利用度良好;新芒果苷、知母皂苷AIII、知母皂苷BII和菝葜皂苷元可跨BBB向脑部转运,其中新芒果苷和菝葜皂苷元入脑吸收较快,菝葜皂苷元的脑血比值最大,同时在血液和脑部的消除时间最长,推测可能为知母防治阿尔茨海默症的主要有效入脑成分。