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共刺激分子4-1BB／4-1BBL在系统性红斑狼疮T淋巴细胞激活中的作用前言系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种以病理性自身抗体产生、高γ球蛋白血症为特点的全身多器官系统受累的自身免疫性疾病。T细胞的异常活化及T-B细胞间的相互作用在系统性红斑狼疮的发病机制中起重要作用，T细胞活化需要双信号：经MHC处理后的抗原通过抗原提呈细胞提供第一信号外，还需要非抗原特异的和非MHC限制的共刺激分子作为第二信号，如CD28／B7、4-1BB／4-1BBL及CD40／CD40L等，才能使T细胞有效地活化、增殖进而发挥其功能，如分泌细胞因子或细胞毒性T细胞的溶细胞效应。要是缺少第一或第二信号，将会导致T细胞的无能、免疫耐受甚至凋亡。近来研究显示共刺激分子的表达或信号异常，均与自身免疫反应的发生和发展密切相关。表达于活化T细胞上的4-1BB和其配体的相互作用，为T细胞的活化提供了独立于CD28信号之外的第二信号，其在诱导T细胞活化、细胞因子分泌并延长其免疫应答效应中的作用逐渐受到重视，4-1BB又名ILA(receptor induced bylymphocyte activation，淋巴细胞激活诱导的受体)和CD137，是一种分子量为30KD的I型膜糖蛋白，以单体或50KD的二聚体的形式表达在活化的T淋巴细胞表面，然而SLE患者T淋巴细胞上4-1BB的表达是否异常国内外研究尚不明确；近来研究表明Th1／Th2细胞因子都可能参与自身免疫性疾病的发生发展，Th1类细胞产生的IFN-γ、IL-12在诱导SLE的发生及Th2细胞产生的IL-4在促进炎症的发展中都起看十分重要的作用，但是4-1BB／4-1BBL是否参与SLE患者T淋巴细胞的增殖及活化后Th1／Th2细胞因子的分泌尚无研究报道，p38MAPK信号转导通路在T淋巴细胞活化并且向Th1和Th2分化过程中是至关重要的，而且NF-kB作为Rel蛋白家族成员，p38MAPK活化后的间接底物，也是Th1和Th2细胞分化中必不可少的转录因子。那么4-1BB／4-1BBL通路是否影响系统性红斑狼疮T淋巴细胞内p38MAPK的信号转导及转录因子NF-kB的活化，目前国内外尚无报道。我们通过对4-1BB在SLE患者T淋巴细胞的表达的系列研究，明确4-1BB／4-1BBL通路在系统性红斑狼疮T细胞激活中的作用，进一步探讨系统性红斑狼疮的发病机制。方法1、选择系统性红斑狼疮患者40例及正常对照者20例，采空腹静脉血提取淋巴细胞，同时应用抗CD3单抗刺激T细胞活化，悬浮于10％胎牛血清的RPMI-1640中培养48小时，应用流式细胞术检测淋巴细胞活化前后CD4~+T细胞和CD8~+T细胞上4-1BB的表达。2、将30例狼疮患者及20例正常对照者静脉血中分离的淋巴细胞培养于10％胎牛血清的RPMI-1640中，并将其分为正常对照组、单纯培养组、抗CD3单抗刺激活化组、抗4-1BB单抗阻断组、地塞米松组。培养48小时后收集各组淋巴细胞培养的上清液，应用ELISA方法检测各组培养上清液中T淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4水平。并且应用MTT法检测T淋巴细胞增殖状态。3、收集上述培养48小时的细胞，应用RT-PCR方法检测各组淋巴细胞p38MAPKmRNA和NF-kB mRNA的表达，应用Western blot方法检测各组淋巴细胞p-p38MAPK及NF-kB蛋白的表达。4、统计学分析：数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验或u检验，不同指标之间进行相关分析。数据用SPSS12.0统计软件处理。结果1、SLE患者T淋巴细胞活化前CD4~+T细胞和CD8~+T细胞上4-1BB的表达均明显高于正常对照组(P＜0.01，P＜0.01)，应用抗CD3单抗刺激活化后CD4~+T细胞和CD8~+T细胞上表达的4-1BB明显增加，与活化前比较有显著差异(P＜0.01)。狼疮患者T淋巴细胞活化前后CD4~+T细胞上4-1BB的表达均高于CD8~+T细胞上4-1BB的表达(P＜0.01，P＜0.01)。T淋巴细胞活化前后4-1BB~+CD4~+T细胞百分数均与免疫球蛋白(IgG)和尿微量白蛋白(MA)呈显著的正相关关系(r=0.623，P＜0.01，r=0.407，P＜0.01，r=0.605，P＜0.01，r=0.463，P＜0.01)。2、SLE患者应用抗CD3单抗刺激活化后T淋巴细胞的增殖明显高于单纯培养组(P＜0.01)，然而应用抗4-1BB单抗阻断4-1BB／4-1BBL通路后T淋巴细胞增殖明显受抑制，与活化组比较有统计学差异(P＜0.01)，地塞米松处理组T淋巴细胞的增殖也明显受抑制(P＜0.01)。3、SLE患者T淋巴细胞培养上清液中IFN-γ和IL-4的水平明显高于正常对照组(P＜0.05，P＜0.05)，而且应用抗CD3单抗刺激活化后，T淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4显著高于单纯培养组(P＜0.01，P＜0.01)，但是应用抗4-1BB单抗阻断4-1BB／4-1BBL通路后T淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4明显受抑制(P＜0.01，P＜0.01)，尤其对IL-4水平的影响最为显著，抑制水平达到50％以上。4、SLE患者T淋巴细胞NF-kB mRNA和p38 MAPKmRNA明显高于正常对照组(P＜0.01，P＜0.01)，而且SLE活化组T淋巴细胞NF-kB mRNA和p38MAPK mRNA的表达显著高于单纯培养组((P＜0.01，P＜0.01))，但是应用抗4-1BB单抗阻断4-1BB／4-1BBL通路后明显降低p38MAPKmRNA的表达(P＜0.01)，但是对NF-kB mRNA的表达无影响(P＞0.05)。5、SLE患者T淋巴细胞NF-kB蛋白和p-p38MAPK蛋白的表达均明显高于正常对照组(P＜0.01，P＜0.01)，而且T淋巴细胞活化后NF-kB蛋白和p-p38MAPK蛋白的表达水平进一步升高(P＜0.01，P＜0.01)。应用抗4-1BB单抗阻断4-1BB／4-1BBL通路后可降低p-p38MAPK蛋白的表达(P＜0.01)，但对NF-kB蛋白的表达无影响(P＞0.05)。结论1、系统性红斑狼疮患者淋巴细胞活化前后CD4~+T细胞和CD8~+T细胞上4-1BB的表达增高。2、应用抗4-1BB单抗阻断4-1BB／4-1BBL通路后，T淋巴细胞的活化与增殖受到抑制，并且明显抑制Th1／Th2细胞因子的分泌。3、阻断4-1BB／4-1BBL通路后可使p38MAPK的信号转导通路明显受到抑制，但是对NF-kB转录因子的活化无明显影响。4、上述结论使我们发现共刺激分子4-1BB在系统性红斑狼疮T淋巴细胞活化中的重要作用，为系统性红斑狼疮发病机制的研究提供一个新的视角，为狼疮等自身免疫性疾病的生物治疗提供了理论基础和新的靶点。