椎间盘突出及术后复发的一个重要原因是纤维环的破损无法自然修复,从而失去椎间盘的预负荷状态和自稳作用。由于椎间盘突出术后复发的存在,一直困扰着医患双方对椎间盘突出的手术方式的选择,完全的椎间盘切除椎间融合虽然能解决复发的问题,但并不符合生理要求,不是一个理想的手术方式,某种程度上是被迫而为。但另一方面,突出髓核的单纯摘除术,虽然更符合生理,确实又存在一定程度的复发,令医患双方都不愿意接受,因此,如何令纤维环愈合修复从而减少或杜绝椎间盘突出的复发,是本课题组一直在研究的一个系列课题。组织工程技术的发展在骨修复、软骨修复等方面已经取得了革命性的进步,其在纤维环破损的修复方面是否能解决纤维环生理愈合的难题?由于纤维环的多层异向结构、无血运、承受应力等特殊性,令纤维环的组织工程更为困难和复杂。取向纳米纤维组织工程支架是本课题另一小组利用丝素蛋白/聚左旋乳酸-聚己内酯[SF/P(LLA-CL)通过静电纺丝技术所制备的一种支架,在前期实验中已经发现其具有较好的应力承受性、体外细胞培养能够生长进入支架内部,显示了良好的组织工程前景。本研究将在已制备支架的基础上,对该支架的降解行为和生物相容性进行观察和验证。支架的降解性能及降解产物对纤维环是否能顺利修复、其生物力学性能是否能匹配生理要求,具有重要的影响。降解的产物及局部微环境的改变不仅影响细胞外基质进而影响细胞增殖、分化和组织工程的效果,也影响生物相容性。为此,本课题围绕以下方面进行重点研究.实验Ⅰ取向纳米纤维组织工程支架体外降解试验目的研究取向纳米纤维支架SF/P(LLA-CL)的体外降解行为,降解过程中取向纳米纤维支架力学性能的变化及降解产物对降解液的影响。方法三种取向纳米纤维支架[SF,P(LLA-CL)、SF/P(LLA-CL)]裁剪成30mm×30mm大小,每种样品各5个标本扫描电镜标记方向后称取其质量(MI)后放入1个盛有20mlPBS(0.1mol/L,PH 7.4±0.1)溶液的瓶子中,共计90个标本,并进行每月换液。分别于1个月、2个月、3个月、4个月、5个月及6个月时间点行三种取向纳米纤维支架干燥后的质量(MF),根据公式计算其质量丢失率((MI-MF)/M1×100%),并测定各降解时间点的降解液PH值,分子量及多分散系数及力学性能的变化。结果随着材料的逐步降解,三种取向纳米纤维支架的PH值、质量及力学性能都下降。1.取向纳米纤维支架SF/P(LLA-CL)的质量丢失率为1-6个月观察点分别为1.600±0.110%,6.433±0.082%,10.183±0.147%,11.650±0.187%,23.267±0.294,29.017±0.293%；取向纳米纤维支架P(LLA-CL)的质量丢失率分别为3.517+0.075%,10.217±0.117%,21.45±0.635%,27.217±0.232%,44.083±4.127%,50.8834-1.963%；取向纳米纤维支架SF的质量丢失率分别为1.033±0.103%,1.967±0.113%,2.233±0.103%,2.467±0.052%,2.900±0.126%,4.883±0.264%。2.取向纳米纤维支架SF/P(LLA-CL)的降解液PH值0-6个月观察点分别为7.403±0.014,7.403±0.005,7.403±0.005,7.218±0.010,6.963±0.012,6.753±0.010,6.860±0.009；取向纳米纤维支架P(LLA-C L)的降解液PH值分别为7.404+0.005,7.238±0.008,7.010±0.009,6.445±0.014,6.287±0.010,5.870±0.009,6.153±0.008；取向纳米纤维支架SF的降解液PH值分别为7.403±0.014,7.415±0.005,7.415±0.005,7.405±0.005,7.405±0.008,7.350±0.020。3.取向纳米纤维支架P(LLA-CL)的在降解前及降解过程中1个月,2个月,3个月及6个月的分子量分别为33.34+3.45,13.21±1.25,5.23±0.22,2.24+0.28,1.32±0.35；其多分散系数分别为33.34±3.45,13.21±1.25,2.244±0.28,1.32±0.35。4.A取向方向上的力学性能：(1)断裂伸长率：取向纳米纤维支架SF/P(LLA-CL)降解前及降解过程中1-4个月观察点分别为70.62±14.24%,20.25±4.34%,9.24±3.21,5.23±1.14%,4.75±1.23%；P(LLA-CL)为80.32±15.24%,30.21±5.25%,8.21±2.35%,—,—；SF为3.83±0.40%,2.85±0.32%,1.05±0.14%,1.04±0.13%,0.85±0.14%。(2)断裂强度：取向纳米纤维支架SF/P(LLA-CL)降解前及降解过程中1-4个月观察点分别为15.60±2.14 Mpa,8.14±1.34 Mpa,5.21±1.23 Mpa,3.32±0.26 Mpa,1.82±0.42Mpa; P(LLA-CL)为20.01±2.87 Mpa,9.21±1.04 Mpa,2.21±0.34 Mpa,—,—；SF为6.71±0.58 Mpa,4.25±0.23 Mpa,3.15±0.21 Mpa,2.544±0.45 Mpa,1.31±0.46Mpa。B.垂直取向方向上的力学性能： (1)断裂伸长率： 取向纳米纤维支架SF/P(LLA-CL)降解前及降解过程中1-4个月观察点分别为50.62±13.24%,24.15±4.15%,10.25±1.23%,4.12±0.25%,1.75±0.26%；P(LLA-CL)为60.32±10.24%,20.15±6.85%,8.42±8.42,—,—；SF为2.24±0.31%,1.15±0.21%,0.85+0.12%,0.75±0.13%,0.50±0.12%。(2)断裂强度：取向纳米纤维支架SF/P(LLA-CL)降解前及降解过程中1-4个月观察点分别为2.06±0.14 Mpa,1.43±0.16Mpa,1.21±0.21 Mpa,0.85±0.13 Mpa,0.50±0.08Mpa；P(LLA-CL)为2.51±0.24 Mpa,1.32±0.16 Mpa,0.62±0.15 Mpa,—,—；SF为0.87±0.13Mpa,0.56±0.14Mpa,0.45±0.15 Mpa,0.32±0.12 Mpa,0.20±0.08Mpa。结论1.取向纳米纤维支架SF/P(LLA-CL)行椎间盘纤维环修复宜在4个月内完成；2.相较取向纳米纤维支架P(LLA-C L)有较低的降解速率,能维持较久的力学性能及较好的降解环境,可能与SF的加入有关。实验Ⅱ取向纳米纤维组织工程支架体内降解试验目的研究SF/P(LLA-CL)取向纳米纤维支架的体内降解行为及降解产物对机体局部微环境的影响。方法取42只6月龄SD大鼠,随机平分7组,每组共6只,记为A,B,C,D,E,F,G组。将制备的两种取向纳米纤维支架P(LLA-CL)及SF/P(LLA-CL)随机植入大鼠背部4个不同皮下部位,每只大鼠植入2个P(LLA-CL)取向纳米纤维支架及2个SF/P (LLA-CL)取向纳米纤维支架。分别于1周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月及6个月时用过量麻醉的方式处死大鼠,支架连带周围部分组织取出后行病理、免疫组化,运用实时-逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)行肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-10(1L-10)炎症因子的相对表达。另取8只6月龄SD大鼠随机平分4组,记为H,I,G,K,随机皮下植入上述两种取向纳米纤维支架,每只大鼠植入2个P(LLA-CL)及2个SF/P (LLA-CL)支架,分别于9个月、12个月,15个月及18个月行最终降解的观察。结果1.病理切片显示,取向纳米纤维支架SF/P (LLA-CL)在6个月内能保持相对完整的结构；2.取向纳米纤维支架P (LLA-CL)在3个月时明显肿胀,并开始分层,6个月时,支架已支离破碎；3.在18个月的观察点未见支架；4.免疫组织化及RT-PCR结果见下。结论相较取向纳米纤维支架P(LLA-CL),取向纳米纤维支架SF/P(LLA-CL)可较长时间保持其结构完整性,两者完全降解的时间为18个月。实验Ⅲ纳米纤维组织工程支架基本理化特性及生物相容性试验目的研究取向纳米纤维支架SF/P(LLA-CL)基本理化特性及生物相容性方法1.将课题组前期已制备好的取向丝素蛋白(SF)、取向聚左旋乳酸-聚己内酯聚合体(P(LLA-CL) w:w=50:50)及取向丝素蛋白/聚左旋乳酸-聚己内酯(SF/P(LLA-CL)w:w=25:75)三种静电纺丝纳米支架,并研究三种取向纳米纤维支架的基本理化性质(直径、表面化学组成、水接触角、力学性能)。2.大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)提取并纯化,鉴别,并种植于上述三种取向纳米纤支架上,行黏附、增殖及BMSCs增殖核细胞抗原(PCNA) RT-PCR实验。3.分别于不同时间点SD大鼠被处死后连带周围部分组织标本行免疫组化及运用RT-PCR行炎症因子基因相对表达(肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白介素-1β(IL-1β),白介素-10(IL-10)及转化生长因子-β(TGF-β))结果1.在X线光电子能谱上Cls、N1s、O1s峰只出现在取向纳米纤维支架SF及SF/P(LLA-CL)上,取向纳米纤维支架的X线光电子能谱上无Nls峰,Cls、Nls、Ols的峰值所对应的键能分别为280ev、390ev、 529ev。2.取向纳米纤维支架SF/P(LLA-CL)其水接触角为80+2度,直径为345±55nm,取向方向的平均断裂伸长率为70.62±14.24%,平均断裂强度为15.60±2.14,垂直取向方向的平均断裂伸长率为50.62±13.24,平均抗张强度为2.06±0.14MPa；取向纳米纤维支架P(LLA-CL)的水接触角为120±3度,直径为235±40nm,取向方向的平均断裂伸长率为80.32±15.24%,平均抗张力强度为20.01±2.87 MPa,垂直取向方向平均断裂伸长率为60.32±10.24%,平均抗张强度为2.51±0.24 MPa；取向纳米纤维支架SF的接触角为0度,直径为220±23nm,取向方向的平均断裂伸长率为3.83+0.40%,平均抗张强度为6.71±0.58MPa,垂直于取向方向断裂伸长率为2.24+0.31%,断裂强度为0.87±0.13MPa。3.成功提取骨髓间充质干细胞(BMSCs)并成功进行纯化、鉴别,成功诱导成骨及成脂细胞。种植于SF/P(LLA-CL)取向纳米纤维支架的BMSCs,其黏附、增殖功能要强于取向纳米纤维支架P(LLA-CL)。4.取向纳米纤维支架SF/P(LLA-CL)的大鼠皮下标本内部及周围无明显的CD68及TRAP阳性细胞,而取向纳米纤维支架P(LLA-CL) 1、3个月较多的巨噬细胞侵入,3个月时在支架周围有异物巨细胞的形成：肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-p(TGF-p)或白介素-1β(IL-1p)和白介素-10(IL-10)在不同的植入时间也有较高的表达水平。结论1.取向纳米纤维支架SF/P(LLA-CL)中的SF主要分布在其表面；2一取向纳米纤维支架SF/P(LLA-C L)具有与纤维环相似的力学性能；3.在生物相容性的主要指标上取向纳米纤维支架SF/P(LLA-CL)要优于P(LLA-CL),其机制可能与SF分布于其表面,增加细胞识别位点,合适的水接触角促进蛋白的黏附等有关。