亚临界二氧化碳烧结共载细胞多孔微球组织工程支架及其性能的研究

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微球烧结组织工程支架是利用“模块化”思想,对材料塑化,使单一的微球彼此黏结形成支架,在组织工程构建中具有重要的地位。CO2作为一种绿色烧结剂,在组织工程构建过程中,具有独特的优势。本文采用复乳法制备聚乳酸羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid,PLGA))多孔微球,以亚临界CO2为烧结剂,将多孔微球烧结成完整的支架,并考察影响微球性能的因素,烧结工艺对支架的影响,微球及其支架的生物学性能。首先以PLGA的二氯甲烷溶液为油相,NH4HCO3的水溶液为内水相,聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)的水溶液为外水相,通过复乳法制备多孔微球。主要考察均质匀化速率、水油比、油相浓度、致孔剂浓度、搅拌速率、外水相浓度等因素对微球粒径、孔径和吸水率的影响。实验结果表明,均质匀化速率为10,000 rpm,外水相与油相体积比为1:3.2,PLGA浓度为6%,发泡剂浓度为10%,搅拌速率为200 rpm,PVA浓度为0.5%的条件下,可制备出平均孔径大于20μm,粒径大于200μm且吸水率良好的多孔微球。顶空气相色谱检测微球中残留的二氯甲烷含量远低于美国药典USP467的上限600 ppm。其次,以多孔微球为基元,考察不同烧结压力、烧结时间、微球粒径对支架性能的影响。实验结果表明,粒径为200350μm,烧结压力为2 MPa,烧结时间为10 min的条件下,可制备出微球平均泡孔大于20μm,压缩强度高(>100kPa),孔隙率高(>85%)的烧结支架。红外光谱、XRD与DSC分析表明,PLGA材料经过亚临界CO2处理后,化学结构、官能团、晶型、玻璃化温度等均未出现明显变化。随后对支架材料进行简单的生物相容性评价。细胞毒性实验结果表明,材料浸提液对细胞生长无抑制作用,细胞形态良好,相对增殖率大于95%,属于1级水平;全身急性毒性实验结果表明,受试小鼠生长状况良好,体重增加明显,肝脏病理学检测无明显炎症反应,即为无毒材料;溶血实验结果表明,材料溶血率低于国家规定的最低限度5%,具有良好的血液相容性;CO2对细胞性能影响的结果表明,亚临界CO2对细胞生理活性无明显影响。最后分别制备共载C5.18与L929两种细胞的多孔微球烧结支架,研究细胞在支架上的生理活性。实验结果表明,一步法构建共载细胞多孔微球烧结支架,可以提高细胞在支架上的黏附率(C5.18:60.00%±2.90%,L929:80.13%±4.19%),同时较大的孔径不仅为细胞提供黏附位点,而且利于成纤维细胞向微球内部生长,细胞持续增殖21天。蛋白分泌实验结果表明,细胞分泌蛋白能力未受亚临界CO2影响(C5.18:1.04±0.065 mg/支架,L929:0.86±0.050 mg/支架)。综上所述,通过一步法制备共载细胞多孔微球烧结支架,不仅保证细胞在高压环境下的活性,同时避免有机溶剂残留、生物活性物质失活等问题。更重要的是“模块化”组织工程构建思想,符合天然组织的构造,为组织工程构建提供新的方法。
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