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【目的】由于创伤、肿瘤、先天性畸形、感染、病理等因素造成的骨组织缺损是临床面临的难题之一,植骨术是解决这一问题的主要方法。现阶段方法的弊端或局限性主要有供源不足、供区损伤和取骨后的并发症、移植排斥反应等。近年来由支架材料、种子细胞和生长因子复合构建的组织工程骨可以改进上述弊端,为临床治疗骨缺损的修复带来美好的前景。本实验将探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2表达载体转染后对BMSCs增殖及成骨转化的影响,在此基础上,进一步观察转染BMP-2基因的rBMSCs在Nano-HA支架中粘附、增殖情况构建仿生人工骨,利用转基因技术,用含目的基因的腺病毒载体转染靶细胞复合到Nano-HA,细胞载体复合物稳定长效地分泌生长因子,体外构建了仿生人工骨,为进一步应用此组织工程骨修复骨缺损奠定基础。【方法】1.取2～3月龄健康新西兰大白兔一只,无菌条件下用18号骨髓穿刺针从胫骨结节外侧穿刺抽取骨髓3～4mL,采用Percoll(1.073 g/ml)分离液分离培养骨髓中BMSCs细胞,留备下一步实验。其中少量细胞进行形态学观察,细胞生长曲线,并采用成骨细胞诱导条件培养基培养,钙钻法检测碱性磷酸酶表达,茜素红染色观察钙结节形成能力。2.部分传代培养的rBMSCs细胞,以腺病毒为载体携目的基因BMP-2/GFP转染rBMSCs,转染后传代培养备用。取部分转染细胞进行如下鉴定: Ad-GFP转染效率的检测,免疫组化、RT-PCR、western blot检测Ad-BMP-2转染后目的基因在rBMSCs的表达。3.胰酶消化收集上述培养的第三代细胞及转染48h后的第三代细胞,制成单细胞悬液,把细胞悬液均匀接种预湿的Nano-HA材料块,材料与细胞复合培养后第d3、d7,分别取两组材料,通过扫描电镜观察材料表面细胞附着、分布、生长情况。Western Blot检测复合后细胞BMP-2蛋白的表达。【结果】1.原代及传代rBMSCs均表现为长梭形改变,呈涡旋状、放射状排列,连续传代培养生长良好,使用条件培养基传代培养3周后,经诱导鉴定可向成骨细胞转化,茜素红染色阳性并形成矿化结节,细胞呈集落生长后开始形成钙结节。2. Ad-BMP-2转染后细胞形态规则,生长旺盛,随培养时间延长细胞体积变大由长梭形向多角形改变的趋势,转染后细胞BMP-2免疫组化检测结果显示胞浆呈阳性表达;RT-PCR检测到大小约338bp大小的阳性条带,转染后细胞BMP-2基因不同时期mRNA水平有高表达;Western-blot检测到约30kD大小的阳性条带,转染后Ad-BMP-2转染组有BMP阳性条带,且随时间的增长条带呈强阳性,而未转染组可见较弱的条带,病毒转染rBMSCs细胞后在蛋白水平也有高表达。3.复合培养3天后,扫描电镜见载体表面不规则,其间可见微孔并且部分被细胞覆盖,转染后的细胞在Nano-HA材料块陷窝和空隙中粘附良好,密集处连接成片,细胞贴附伸展良好。复合7天后细胞在材料表面完全铺展,并伸出伪足,与材料表面融合紧密,细胞周缘可见钙盐分泌及沉积。提取细胞载体复合上的细胞,western-blot检测转染组在第三、第五天有BMP-2蛋白有高表达,转染后的细胞载体复合物可继续分泌BMP-2。【结论】1.BMSCs细胞取材方便,采用密度梯度离心法能分离获得大量实验用BMSCs。BMSCs培养性能稳定,便于传代扩增,在一定诱导条件下可转化为成骨细胞,适合于作为骨组织工程的种子细胞。2.采用GatewayTM技术构建了携带hBMP-2的重组腺病毒载体,能高效转染培养的骨髓间充质干细胞,转然后能够高效、持续表达、分泌BMP-2蛋白。3.成功体外构建BMP-2基因强化的组织工程仿生人工骨。