研究背景和目的结肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤,近年来其发病率呈逐年增高趋势,结肠癌的局部复发、淋巴结转移、血行播散性转移是造成结肠癌患者死亡的主要原因之一。结肠癌早期即可出现淋巴结转移,进展期常常会出现肝脏、肺转移及腹腔播散。目前认为结肠癌的生长、转移涉及多方面的因素,包括肿瘤细胞出现抗凋亡、肿瘤细胞侵袭、肿瘤细胞迁移、肿瘤细胞逃避免疫监视。最近研究表明细胞因子受体在肿瘤细胞的表达直接影响着肿瘤细胞的淋巴及血行转移,影响着不同肿瘤的转移部位及转移进程。细胞因子受体CXCR4最初是作为调节淋巴细胞在炎症反应中归巢的重要受体被发现的,其天然配体是SDF-1(stromal cell derived factor-1,基质细胞衍生因子-1),又称CXCL12。CXCR4目前被证实是肿瘤细胞粘附和/或迁移的重要因子,SDF-1在肿瘤常见的转移部位通常存在高表达,如肺脏、肝脏、淋巴结。目前认为SDF-1-CXCR4生物学轴是介导肿瘤侵袭和转移的重要机制,例如：在乳腺癌及口腔鳞状细胞癌中均发现CXCR4存在高表达。越来越多的证据支持肿瘤中存在肿瘤干细胞。所谓的“肿瘤干细胞”是指那些具有自我更新能力的肿瘤细胞,其增殖及迁移推动了肿瘤的进展。目前已在多种实体瘤中发现存在肿瘤于细胞。从最初在造血干细胞中发现,到现在CD133已经在多种实体瘤中被认为是肿瘤干细胞的标记物,如：脑胶质瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌及黑色素瘤。尽管目前对于CD133的功能并不是十分清楚,现有证据表明CD133可能与干细胞信号转导、肿瘤凋亡抵抗等机制密切相关。由于肿瘤干细胞具有强大的增殖及转移能力,其被认为是未来肿瘤治疗的靶点。现有证据表明CXCR4和CD133参与了肿瘤的侵袭、转移及肿瘤恶性生物学行为的维持,然而,目前并未有同时研究CXCR4和CD133在结肠癌中表达及预后的报道。在本研究中,我们分析了CXCR4和CD133在结肠癌中的表达及其与临床病理特征及预后的关系。此外,我们还选取了结肠癌细胞株4株,分析其CXCR4和CD133的表达情况,及其在体外对SDF-1的趋化迁移能力。方法收集2001年1月至2005年7月在中山大学第一附属医院行手术治疗的结肠癌患者石蜡包埋标本125例,其中TNM分期Ⅱ期患者61例,Ⅲ期患者64例。所有患者均接受过结肠癌根治术,术后病理确诊为结肠癌,所有患者在手术前均未接受过新辅助化疗或放疗。患者术后接受何种辅助治疗均按照NCCN指南根据相应的分期及复发风险执行。运用免疫组化的方法检测CXCR4和CD133在Ⅱ、Ⅲ期结肠癌原发灶及淋巴结转移灶中的表达。所有病理标本均由完全不了解本研究患者相关临床资料及预后的病理科医生阅片。并进一步运用统计学方法分析CXCR4和CD133在结肠癌中的表达情况与患者临床病理特征及5年生存率之间的关系。选取4株人结肠癌细胞株：SW480、SW620、HT-29、lovo细胞,运用免疫印迹法检测4株结肠癌细胞株中CXCR4和CD133的表达情况,并进一步运用流式细胞仪检测结肠癌细胞株CXCR4和CD133的表达情况。Transwell迁移实验分析SW480、SW620、HT-29和lovo细胞在体外对SDF-1的趋化迁移能力。统计学处理：免疫组织化学得分与患者临床病理特征之间的两样本率比较采用四格表资料的χ2检验,多样本率的比较采用行列表资料的χ2检验。如果某一个分组的样本特别小,相关性分析则采用Fisher’s精确检验法。生存分析检验方法采用log-rank检验,并通过绘制Kaplan-Meier生存曲线来表现临床病理特征对生存的影响。采用SPSS13.0软件包(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)对结果进行统计学分析。在本研究中以P<0.05为差异有显著性意义的检验标准,所有P值均是双侧检验分析的结果。结果在125例患者中共有102例患者可在同一张切片上找到瘤旁结肠上皮组织。在102例瘤旁结肠上皮组织中,CXCR4仅在11例(11/102,10.8%)瘤旁结肠上皮组织中出现表达；CD133仅在8例(8/102,7.8%)瘤旁结肠上皮组织中出现表达。在125例结肠癌组织中,有74例为CXCR4阳性表达(74/125,59.2%)。CXCR4表达的主要形式为细胞质表达,部分患者可见有细胞膜表达,在本研究中并未发现有细胞核表达。在125例结肠癌组织中,45例发现存在CD133的表达(36.0%,45/125)。CD133在结肠癌中的表达呈现极性分布,在存在腺体样分化的结肠癌中,只有那些与腺腔直接接触的肿瘤细胞才有可能表达CD133,CD133的表达通常位于腺腔的尖端。一些CD133阳性的肿瘤细胞通常聚集在一起,导致整个腺体全部或大部分呈阳性表达。在125例Ⅱ、Ⅲ期结肠癌患者中,单独分析CXCR4或CD133的表达与患者临床病理特征之间的关系,并未发现CXCR4或CD133的表达与患者年龄、性别、原发灶部位、病理分级、肿瘤大小、AJCC分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况存在相关性。将CXCR4与CD133的表达结合在一起分析,我们可以得到四种组合：CXCR4阳性/CD133阳性、CXCR4阳性/CD133阴性、CXCR4阴性/CD133阳性、CXCR4阴性/CD133阴性。结果发现：125例患者中CXCR4和CD133共表达(CXCR4阳性/CD133阳性)的患者有29例(23.2%)。分析CXCR4和CD133共表达与患者各种临床病理特征之间的关系,结果发现CXCR4与CD133的共表达与患者AJCC分期(P=0.029)及淋巴结转移(P=0.020)有明显的相关性,CXCR4与CD133共表达的患者其AJCC分期更高,且更易出现淋巴结转移。我们同时选取64例Ⅲ期结肠癌患者的淋巴结转移灶,运用免疫组织化学法分析淋巴结转移灶中CXCR4和CD133的表达情况。在64例Ⅲ期结肠癌患者的原发灶中,有41例(64.1%)患者高表达CXCR4,在64例Ⅲ期结肠癌患者的淋巴结转移灶中有43例(67.2%)高表达CXCR4。在64例Ⅲ期结肠癌患者的原发灶中,有27例(42.2%)患者高表达CD133,而在64例Ⅲ期结肠癌患者的淋巴结转移灶中仅有15例(23.4%)高表达CD133。淋巴结转移灶中CD133的表达较原发灶明显下降(P=0.024)。在64例Ⅲ期结肠癌患者的原发灶中,20例(31.3%)患者存在CXCR4与CD133的共表达,在64例Ⅲ期结肠癌患者的淋巴结转移灶中仅有9例(14.1%)患者存在CXCR4与CD133的共表达。CXCR4与CD133结合起来分析发现,CXCR4和CD133共表达在淋巴结转移灶中较原发灶明显降低(淋巴结转移灶14.1%VS原发灶31.3%,P=0.020)。所有患者均进行严密随访以评价CXCR4与CD133的预后价值。中位随访时间为6.5年。随访过程中共有36例发生死亡,3例出现失访。Log-rank生存分析及多因素生存分析均发现：AJCC分期、淋巴结转移、CXCR4表达、CD133表达、CXCR4和CD133共表达是独立的生存预后因素。运用Kaplan-Meier生存曲线分析CXCR4和CD133共表达的预后意义,结果表明：CXCR4和CD133共表达是显著预后不良的因素。在本研究的125例结肠癌患者中,有29例患者存在CXCR4和CD133共表达,这29例患者的5年生存率显著降低,仅为51%,剩余患者的5年生存率为77%(P=0.005)运用免疫印迹法检测结肠癌细胞株SW480、SW620、HT-29、lovo细胞中CXCR4和CD133的表达情况,结果显示：CXCR4在SW480细胞、SW620细胞和HT-29细胞中表达水平均较高,免疫印迹法分析CXCR4在上述三株细胞的表达水平大致相当,但CXCR4在lovo细胞中表达水平明显较上述三株细胞降低；CD133在四株结肠癌细胞株中也均有表达,其中在SW480细胞中的表达最强,在SW620和HT-29细胞中的表达稍弱,在lovo细胞中的表达最弱。运用流式细胞法检测结肠癌细胞株SW480、SW620、HT-29、lovo细胞中CXCR4和CD133的表达情况,结果显示：SW480细胞是所选四株细胞中CXCR4和CD133双阳性细胞所占比例最高的,其CXCR4和CD133双阳性细胞所占的比例为39%；SW620细胞中CXCR4和CD133双阳性细胞所占的比例为26%；HT-29细胞中CXCR4和CD133双阳性细胞所占的比例为23%；lovo细胞CXCR4和CD133双阳性细胞所占的比例在所选四株细胞中最低,仅为11%。运用Transwell迁移实验分析不同结肠癌细胞株的迁移能力,结果显示：SW480细胞侵出小室的细胞数目最多,迁移能力最强,平均每个高倍视野中侵出小室的细胞数为82.4±8.5个；SW620和HT-29细胞侵出小室的细胞数目较SW480细胞少,平均每个高倍视野中侵出小室的细胞数分别为50.4±8.96个和44.4±8.72个；lovo细胞侵出小室的细胞数目最少,迁移能力最弱,平均每个高倍视野中侵出小室的细胞数为23.5±6.4个。结论在125例Ⅱ、Ⅲ期结肠癌患者中,单独分析CXCR4或CD133的表达与患者各种临床病理特征之间的关系,并未发现存在相关性。进一步分析发现CXCR4和CD133共表达与患者AJCC分期及淋巴结转移有明显的相关性,CXCR4和CD133共表达的结肠癌患者淋巴结转移发生率显著升高。生存分析表明CXCR4和CD133共表达是独立的生存预后因素,存在CXCR4和CD133共表达的结肠癌患者5年生存率显著降低。CXCR4和CD133的表达在所选的4株结肠癌细胞株中存在明显差异,这种差异影响着肿瘤细胞在体外对SDF-1的趋化迁移能力。Transwell迁移实验结果表明：肿瘤细胞体外迁移能力与CXCR4和CD133双阳性细胞所占的比例有关,双阳性细胞所占比例高的细胞株具有更强的迁移能力。CXCR4和CD133共表达是Ⅱ、Ⅲ期结肠癌患者预后不良的因素之一,而且CXCR4和CD133双阳性结肠癌细胞在体外具有更强的趋化迁移能力,这些结果表明CXCR4和CD133可能参与到结肠癌的发展和转移过程中。