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由水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)引起的白叶枯病是水稻生产上最严重的细菌性病害之一。近年来,在对Xoo致病性分子机理的研究中发现,其极生单鞭毛不仅是一种重要的运动器官,而且是潜在的致病因子之一。本室前期对Xoo鞭毛生物合成调控机理的研究表明,其鞭毛组装与调控有关的基因位于一个大约由60个基因组成的鞭毛基因簇中,其中转录调控因子FleQxoo协同σ54因子(RpoNxoo)对鞭毛运动性及其基因表达具有调控作用。然而,有关FleQxoo对鞭毛生物合成及其基因表达的调控机理尚不清楚。本研究通过对FleQxoo原核表达和纯化、与鞭毛基因启动子结合作用、鞭毛基体蛋白基因fliExoo缺失突变以及相关表型的测定,对Xoo鞭毛生物合成的调控机理进行了分析。研究目的和意义在于阐明FleQxoo作为转录主控因子在Xoo鞭毛运动性表达中的作用机理,为进一步发展新型、有效和可持续的病害控制策略提供科学依据。1. FleQxoo与鞭毛基因启动子结合。根据KACC10331菌株全基因组序列,设计fleQxoo扩增引物,用PCR方法从Xoo野生型菌株PXO99A基因组DNA中克隆了该基因。构建了原核表达载体pET21-fleQxoo,将其转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS中,用IPTG进行了诱导表达。用Ni-NTA亲和层析纯化表达蛋白,经抗组氨酸单克隆抗体检测,获得了分子量约为56 kDa的FleQxoo蛋白。对部分鞭毛基因进行了启动子分析和克隆。用不同量的FleQxoo纯化蛋白与鞭毛基因启动子孵育,通过凝胶阻滞试验测定法(EMSA)检测了它们的结合作用。FleQxoo在体外能特异地与鞭毛基因fliExoo、flgFxoo和flhFxoo启动子片段发生结合。因此,FleQxoo可能通过与鞭毛基因启动子的直接结合调控了这些基因的转录。2.鞭毛基体蛋白基因fliExoo缺失突变。通过利用标记基因GmR以及同源重组交换法,构建了鞭毛基体蛋白基因缺失突变体△fliExoo。与PXO99A相比,△fliExoo鞭毛缺失,菌体易沉降,泳动能力明显降低;尽管生长速率和胞外纤维素酶活性无显著改变,但胞外多糖产生和生物膜形成能力明显下降;对水稻的致病性和引起烟草的过敏性反应都有所减弱;基因互补可以使上述突变体表型有所恢复。因此,fliExoo突变不仅影响了鞭毛运动性,而且也影响了与毒性相关的表型。3.不同鞭毛基因缺失突变体生物膜检测。分析了不同培养条件(塑料和玻璃表面、时间、温度和培养基)对Xoo生物膜形成的影响,利用结晶紫染色法测定了不同菌株生物膜形成能力。在聚苯乙烯表面上生长、用M210培养基、在23℃温度下、静止培养24 h是Xoo生物膜形成比较适宜的测试条件;鞭毛调控或组成基因fleQxoo、fliExoo和rbfCxoo的缺失突变均影响生物膜形成。不同地区来源的菌株产生生物膜能力存在差异,而这些差异与地区来源无关;因此,Xoo生物膜形成受到鞭毛合成调控或组成基因突变的影响。总之,本研究为阐明转录调控因子FleQxoo通过结合靶启动子调控Xoo鞭毛基因的表达提供了直接证据。