本文研究内容包括两大部分,即NK细胞的雌激素调控及其在子痫前期发病过程中的机制研究及肾间质纤维化的发生与干预。一、雌激素可调控NK细胞的功能,影响子痫前期发生和发展。胎儿做为半同种移植物,携带有父系MHC分子,但却不会使母体发生较高的免疫排斥,这种特殊的母胎免疫耐受,无法用经典的移植免疫耐受或肿瘤免疫逃逸理论来解释。研究发现,子痫前期发生过程中,伴随母体雌性激素水平的显著变化,免疫细胞的功能也发生改变,其中主要变化的免疫细胞是外周血和蜕膜组织中的NK细胞。已有许多研究发现雌性激素在免疫细胞(特别是T淋巴细胞和B淋巴细胞)的调控中发挥重要的作用,但关于雌性激素是否影响NK细胞的功能迄今还无定论,其调控机制尚待阐明。因此,本研究首先构建了妊娠特有疾病一子痫前期(PE)样小鼠模型,分析了NK细胞在PE发病中的可能作用,并进一步通过体内体外实验探讨了重要的雌性激素—17p-雌二醇(E2)对NK细胞功能的影响及其调控机制。我们参照报道建立了PS/PC秀导的PE样小鼠模型,分析了NK细胞在外周血、脾脏及子宫的数量、表型以及外周血中的细胞因子水平。结果表明,在PS/PC处理后gd11.5天时,子宫中NK细胞数目突然增加,随后逐渐降低,且在gd14.5和17.5天时比NK细胞数目比对照组的明显减少；PS/PC处理组的CD244、CD94及NKG2D的表达在外周血上调,而在子宫处下调,但CD122在脾脏和子宫均呈低表达；在PS/PC处理后,小鼠外周血中的TGF-β显著增加,而TNF-α和IFN-γ的表达与对照组之间没有差异。这些结果提示,子宫NK细胞的数量减少,CD244、CD94ωCD 122及NKG2D表达下调可能与母胎免疫耐受有关。PS/PC处理后小鼠外周血中TGF-β的增加也可能影响NK细胞的表面分子表达及活化,进而影响母胎界面的免疫平衡。接着我们用磁珠法从小鼠脾脏分离获得高纯度NK细胞,经不同浓度E2作用后,检测了其表型、细胞毒性及功能变化。结果表明,E2可抑制NK细胞的细胞毒性和增殖活性,促进NK细胞抑制性受体CD94的表达以及IFN-γ的分泌。这些结果提示E2的抑制作用可能是通过影响NK细胞表型及细胞因子分泌发挥的。基因芯片结果表明,E2也影响与细胞毒性或增殖相关的基因如Stat4、Fyn、Sh2d1a、Eat2、Cd244、Irf1、Runx1、Irf7、Irf5、Esrra和Nr5a1等的表达,关于这些基因在NK细胞中的详细作用机制还需进一步研究。我们还构建了卵巢切除(OVX)小鼠模型,分析了不同组小鼠脾脏和子宫来源的NK细胞的表型、功能以及相关基因。结果表明,E2可显著增加NK细胞的数量,但同时降低NK细胞的细胞毒性。E2也可上调MCM7和MCM10的表达,MCM7和MCM10分子是DNA复制所必需的,且与细胞增殖有关,提示E2可能是通过上调MCM7和MCM10的表达调控NK细胞的数量。另一方面,E2可下调NK细胞表面的CD69、NKp46、NKG2DL和2B4 (CD244)等分子,这些分子是NK细胞的活化受体,提示E2对NK细胞毒性的抑制可能归结于其表面活化受体的表达下调。综上所述,我们以子痫前期为研究模型,阐述了NK在介导母胎免疫耐受中的重要作用,并首次通过体内外实验系统地探讨了E2对NK细胞的影响及其作用机制。本研究结果将有助于解释NK细胞在母胎免疫耐受及PE发病中的作用机制,以便为临床诊断和治疗提供理论依据。二、肾脏纤维化的发生于干预肾脏纤维化是各种肾脏病终末期的共同表现,以细胞外基质(ECM)沉积导致肾间质纤维化为重要特征。研究表明,肾脏纤维化时可表达多种致肾毒性因子及激活多条信号通路,其中组织型纤溶酶原激活剂(tPA)在肾脏纤维化时表达异常升高,提示tPA与肾脏纤维化的发生发展有着密切的联系,然而相关报道及调控机制至今尚不清楚。首先我们探讨了tPA对肾间质纤维细胞的影响。结果表明,tPA可促进大鼠肾脏纤维细胞系(NRK-49F)的增殖和细胞周期进程。tPA的这种促增殖作用是通过上调一系列增殖相关蛋白(c-fos、c-myc、PCNA和Cyclin D1)的表达来实现的,并且tPA的这种促增殖活性不依赖于其蛋白酶活性,而是通过与膜受体LRP-1相结合,招募p1整合素,激活胞内信号通路而引发的。进一步发现,tPA可以快速诱导β1整合素下游激酶FAK的磷酸化,进而激活MAP激酶信号通路；此外我们还证实,tPA基因缺陷小鼠在肾脏阻滞受损后,纤维化程度远远低于野生型对照,PCNA表达显著降低,并且间质纤维细胞增殖明显减少。这些结果表明,tPA可作为一个潜在的促纤维细胞增殖的有丝分裂原,通过结合其膜受体LRP-1以及β1整合素,使FAK磷酸化,激活下游MEK1/2-Erk1/2信号通路,进而诱导增殖相关基因表达,加快细胞周期进程而促进间质纤维细胞增殖。有效且可完全制止肾间质纤维化进展的药物尚缺。肾脏纤维化关键信号通路的阐明可为有效的预防和干预措施提出新靶标。研究报道,肾脏纤维化时Wnt/β-catenin信号通路异常活化,提示其可能是抗纤维化的一个潜在的治疗靶点。因此,我们深入探讨了Wnt/β-catenin在纤维化时EMT中的作用,并评估β-catenin特异性小分子抑制剂ICG-001对抗纤维化的疗效。构建了稳定持续活化表达β-catenin的HKC-8细胞系,发现E-cadherin表达下降,Snail-1、纤连蛋白和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)表达升高。荧光素酶报告基因法检测结果表明,ICG-001可以直接抑制β-catenin启动子的转录活性,还能消除由TGF-β引起的HKC-8细胞Snail、PAI-1、I型胶原、纤连蛋白以及α-SMA的表达,而其抗纤维化作用并不是通过影响TGF-β-Smad信号通路而完成的；此外,我们还构建了经典的肾脏纤维化UUO小鼠模型,检测ICG-001对纤维化的治疗效果。结果表明,ICG-001可以显著减轻纤维化的病变程度,还可抑制EMT关键的转录调控因子Snail和Snail 2/Slug的表达。这些研究结果说明,用小分子化合物ICG-001特异性阻断Wnt/β-catenin/CBP信号通路可有效抑制肾脏纤维化的进展,提示Wnt/β-catenin/CBP信号通路可能是治疗肾脏纤维化的一个新靶点。综上我们首次发现tPA具有促进肾间质纤维细胞增殖的作用。tPA功能的发挥,与其蛋白酶活性无关,而是通过结合细胞膜受体LRP-1,招募β1整合素,进而激活其下游的FAK-Eek1/2信号通路,引起细胞周期及增殖相关基因的表达,加速细胞周期进程而促进细胞增殖,最终促进肾脏纤维化的发展；而β-catenin特异性小分子化合物ICG-001可有效阻断Wnt/β-catenin/CBP信号通路,减缓和改善肾间质纤维化的进展,可作为一个抗纤维化的的新靶点及潜在的药物。