背景:肠道胆汁酸缺乏症(Intestinal bile acid deficiency,IBAD)是由于各种原因导致胆汁酸合成减少、丢失过多或胆汁流出道受阻而出现的肠腔内胆汁酸缺乏的一种病症,常继发于梗阻性黄疸和胆汁外引流等。肠道胆汁酸的缺乏将导致肠道的消化和吸收功能障碍、糖脂代谢紊乱、屏障功能受损以及菌群失调等,严重危害人类健康。法尼酯X受体(farnesoid X receptor,FXR)是重要的胆汁酸受体,参与调节胆汁酸的合成、转运与代谢,维持胆固醇的稳态。随着研究的不断深入,FXR在调控葡萄糖代谢和能量平衡中的功能逐渐被揭示,以此为基础开发的分子靶向药物逐步得到推广,并有望成为治疗糖尿病、肥胖等代谢性疾病的新型药物。然而,FXR在胆汁酸调节肠道葡萄糖平衡中的作用以及通过肠道对机体葡萄糖代谢的影响,目前尚不清楚。因此,阐明IBAD相关性糖代谢紊乱的发病机制,探讨胆汁酸及FXR在调控肠道葡萄糖平衡中的具体作用,具有极其重要的临床意义和科学价值。目的:本项目通过分析IBAD患者的临床资料,明确肠道胆汁酸缺乏与糖代谢的关系。通过构建肠道胆汁酸缺乏小鼠模型,进行基因表达微阵列(Microarray)分析,筛选并验证FXR在IBAD患者及小鼠肠道中的表达模式及功能。进一步通过体外、体内实验阐明FXR在胆汁酸调节小肠细胞葡萄糖吸收和代谢,以及肠粘膜葡萄糖转运中的作用及其细胞分子机制,探讨FXR影响机体葡萄糖代谢的新思路,为FXR激动剂治疗IBAD相关性糖代谢紊乱提供了理论基础。方法:1.统计分析248例IBAD(轻度56例、中度66例、重度126例)和58例非IBAD患者的血糖水平,明确肠道胆汁酸缺乏后机体葡萄糖代谢的变化;2.构建小鼠肠道胆汁酸缺乏模型,送检空肠样本进行Microarray分析,通过差异基因聚类分析及通路富集分析,利用qRT-PCR、Western Blot和免疫组化等技术研究肠道胆汁酸缺乏后胆汁酸受体及葡萄糖转运体的变化;3.收集24例IBAD和21例非IBAD患者的空肠样本,Western Blot检测FXR表达变化,qRT-PCR分析葡萄糖转运体SGLT1和GLUT2的m RNA水平,Pearson相关性分析研究SGLT1、GLUT2 m RNA表达与患者血糖变化的关系;4.应用2-NBDG荧光标记葡萄糖类似物,分析胆汁酸对小肠细胞葡萄糖吸收的影响;通过沉默FXR或应用FXR激动剂、拮抗剂观察FXR在胆汁酸调节小肠细胞葡萄糖吸收中的作用;5.应用鹅脱氧胆酸(CDCA)、葡萄糖及FXR拮抗剂处理小肠细胞,Western Blot和免疫荧光技术分析FXR对SGLT1和GLUT2的影响;6.基于肠道胆汁酸缺乏小鼠空肠Microarray分析结果,Western Blot检测胆汁酸及FXR调节小肠细胞葡萄糖吸收的相关信号通路,并应用通路抑制剂进行验证;7.通过数据库预测及文献检索,预测FXR调节小肠细胞葡萄糖吸收相关通路的中间靶点(S1PR2),并应用该靶点激动剂、拮抗剂及si RNA,结合Western Blot、qRT-PCR及免疫共沉淀(CO-IP)等技术探讨FXR与S1PR2的关系;8.应用海马细胞能量代谢分析平台,研究FXR在胆汁酸调节小肠细胞葡萄糖代谢中的具体作用;9.通过葡萄糖耐量试验,探讨FXR最强内源性激动剂CDCA对小鼠葡萄糖水平的影响;10.利用Ussing Chamber系统,检测CDCA、FXR激动剂/拮抗剂及GLUT2抑制剂对葡萄糖跨肠粘膜上皮转运能力的影响;11.应用菊粉实验检测FXR激动剂对肠壁通透性的影响;12.应用FXR激动剂和/或葡萄糖灌注、孵育小鼠小肠,提取肠道刷状缘膜(BBM)蛋白,Western Blot检测FXR对SGLT1和GLUT2的影响。结果:1.肠道胆汁酸缺乏后,患者空腹血糖水平升高,且与肠道胆汁酸缺乏程度密切相关。在无缺乏及轻度、中度和重度缺乏患者中,空腹血糖水平异常升高的比例分别为6.90%(4/58)、16.07%(9/56)、22.73%(15/66)和27.78%(35/126);2.基因表达Microarray分析及qRT-PCR提示小鼠肠道胆汁酸缺乏后空肠FXR、GLUT2和SGLT1 m RNA水平升高,Western Blot及免疫组织化学染色显示FXR表达下降,进一步的泛素化水平检测显示胆汁酸缺乏后的小肠泛素化水平显著升高,提示胆汁酸可在转录后水平调控FXR的表达;3.Western Blot结果发现IBAD患者小肠FXR表达降低,GLUT2表达升高,而SGLT1无显著变化,免疫组化结果证实增加的GLUT2主要位于肠绒毛上。qRT-PCR结果显示IBAD患者空肠GLUT2 m RNA水平升高,SGLT1 m RNA表达无明显改变;Pearson相关性分析提示IBAD患者血糖水平与空肠GLUT2 m RNA表达呈现正相关(p=0.0001,r=0.5426),与SGLT1 m RNA的变化无关(p=-0.8745,r=0.0012);4.2-NBDG葡萄糖吸收实验显示胆汁酸可通过FXR促进小肠细胞的葡萄糖吸收;5.Western Blot及免疫荧光结果显示胆汁酸激活的FXR可通过增加细胞膜上GLUT2的表达促进小肠细胞的葡萄糖吸收;6.基于小鼠Microarray分析结果及Western Blot验证,发现FXR可通过激活MEK/ERK通路促进细胞的葡萄糖吸收,应用该通路抑制剂U0126证实了上述结果;7.基于文献检索及进一步的实验验证,发现FXR调控MEK/ERK通路的中间靶点为S1PR2;应用该靶点的配体和拮抗剂证实S1PR2可促进小肠细胞葡萄糖吸收;应用FXR si RNA、激动剂和拮抗剂及S1PR2 si RNA和配体S1P,结合Western Blot和CO-IP等技术,证实FXR可通过与S1PR2结合来调控下游MEK/ERK信号通路的激活;8.海马细胞能量代谢分析显示,胆汁酸激活的FXR抑制了小肠细胞的氧化磷酸化水平,减少了细胞ATP的生成,而对细胞的糖酵解水平无显著影响。9.葡萄糖耐量试验显示,FXR最强的内源性激动剂CDCA可抑制小鼠血糖水平的升高,提示FXR可能通过肠道来抑制葡萄糖的跨上皮转运;10.Ussing Chamber实验显示,胆汁酸可通过FXR调节GLUT2的表达来抑制小鼠葡萄糖的跨上皮转运;11.菊粉实验结果表明,肠道FXR的激活并未改变肠壁的通透性(p>0.05),提示FXR调节的肠道葡萄糖跨上皮转运与肠壁通透性无关;12.BBM实验显示FXR激活可调整肠粘膜上皮SGLT1/GLUT2的比例,从而抑制肠道葡萄糖的跨上皮转运。结论:IBAD患者空腹血糖水平异常升高的比例显著增加,与肠道内胆汁酸的缺乏程度密切相关;肠道胆汁酸缺乏后小肠内FXR表达降低,FXR信号激活减少,GLUT2在刷状缘膜上富集增多,血糖水平升高,提示GLUT2可能成为治疗IBAD相关性高糖血症的重要靶点。体外实验,胆汁酸激活的FXR一方面可通过S1PR2调节的MRK/ERK信号增加小肠细胞膜上GLUT2的表达,促进细胞的葡萄糖吸收;另一方面,FXR的激活抑制了小肠细胞的氧化磷酸化过程,ATP生成减少。由于小肠细胞葡萄糖转运是一个需要Na+-K+ATP酶参与的高度耗能过程,ATP生成的减少将直接影响Na+-K+ATP酶的功能,导致细胞的葡萄糖转运减少。体内实验,胆汁酸引起FXR的激活可抑制肠道中葡萄糖的跨上皮转运,这与FXR调整了小肠刷状缘膜上SGLT1/GLUT2的比例有关。因此,FXR在胆汁酸调节的小肠细胞葡萄糖吸收及葡萄糖跨上皮转运过程中发挥了重要作用。本研究基本阐明了IBAD患者高血糖发生的原因,明确了胆汁酸调节FXR可通过肠道影响机体的葡萄糖代谢,为FXR激动剂治疗IBAD相关性糖代谢紊乱提供了理论依据。