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研究背景:过敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura,HSP）,也称为IgA血管炎（IgA vasculitis,IgAV）,是一种由于免疫球蛋白A1（IgA1）介导的血管变应性出血性疾病,常涉及皮肤、胃肠道、关节和肾脏。HSP是儿童时期最常见的自身免疫性小血管炎性疾病,也是血管病最常见的形式之一,其报告的年发病率为10—20/100,000,由于诊断及鉴别诊断复杂,可能由于漏报而低估了HSP的发病率。HSP多发于儿童,并在4至6岁时出现高峰发病率,近年来临床观察到其发病年龄越来越小龄化,且发病率有呈上升的趋势。尽管HSP已经被认识超过200年,是最常见的血管炎之一,但是其发病机制尚未解决。研究表明,HSP可能与感染、疫苗接种、花粉、蚊虫叮咬、食物、药物和免疫因素有关。许多报道显示,感染,尤其是β-溶血性链球菌感染,可能是这种疾病的潜在诱因,导致人体大量IgA、IgE等的产生,从而引起机体一系列的免疫反应。人类的健康是由内因和外因共同决定的,其中内因由基因组及第二基因组构成,“第二”基因组又称为微生物组。肠道菌群与其宿主相互作用影响的统一体称为肠道微生态。它们和人体有着密不可分的互利共生关系,直接影响着每个人的健康。肠道菌群在食物的消化吸收、有益营养物质的产生、免疫功能的调节以及外来致病菌入侵的防御等方面都有着重要的作用。有文献报道,肠道菌群失调与很多免疫性疾病的发生相关,包括湿疹、食物过敏、过敏性哮喘、类风湿性关节炎以及系统性红斑狼疮等。近年来HSP患儿的肠道菌群紊乱也有报道,但研究存在涉及的样本数较少,对各疾病分型研究不深入和采用的技术落后等问题。研究目的:本实验旨在研究HSP患儿肠道菌群紊乱情况,分析肠道菌群多样性、组成、标志微生物等特点,以及肠道菌群与住院天数、IgA、IgE等临床指标和免疫指标的相关性,并探讨利用肠道菌群生物标志物对HSP患儿病情的诊断和指导作用。研究方法:收集2017年在山东大学齐鲁儿童医院住院治疗的HSP患儿290例,从中纳入符合入组标准的225例患儿进行研究。采集患儿临床信息,并利用高通量测序技术,对患儿大便菌群进行16S rRNA的测序,与70名健康对照的肠道菌群进行对比,并利用LEfSe,SPSS等软件对肠道菌群差异进行分析比对。利用随机森林机器学习模型对肠道菌群生物标志物进行筛选,其对于HSP的诊断能力评估采用受试者工作特征（Receiver operating characteristics,ROC）曲线分析。研究结果:225名HSP患儿中,单纯型HSP患儿29人,腹型HSP患儿49人,关节型HSP患儿57人,肾型HSP患儿5人,混合型患儿85人。卡方检验结果显示两组间男女性别比例没有统计学差异（P>0.05）。HSP组平均年龄（7.1±2.5岁）和健康对照（7.0±2.7岁）相比没有统计学差异（P=0.58）,ANOVA分析结果表明不同亚型组的年龄与健康对照组相比没有统计学差异（P=0.07）,但是不同亚型组之间年龄具有年龄差异（P=0.04）。225位HSP患儿和70位健康对照的肠道菌群经测序后,我们分析了HSP患儿和健康儿童肠道菌群的α-多样性,结果表明HSP患儿肠道菌群在Shannon指数（2.98±0.67 vs 3.35±0.60,P<0.0001）,Ace指数（481.03±92.41 vs 540.12±90.52,P<0.0001）等方面均低于健康对照,且具有统计学差异。我们进一步分析了不同 HSP分型患儿肠道菌群的α-多样性,其中,肾型HSP患儿在Sobs,Shannon,Chao和Ace指数方面均与健康对照组没有显著差异（P>0.05）。在Sobs指数方面,健康对照组比单纯型HSP（375.66±68.18 vs299.86±65.20,P<0.0001）,腹型HSP（375.66±68.18 vs293.80 ±72.53,P<0.0001）,关节型HSP（375.66±68.18 vs 300.72±58.06,P<0.0001）,混合型HSP（375.66±68.18 vs 297.28±82.77,P<0.0001）。在Shannon指数方面,健康对照组比单纯型HSP（3.35±0.60vs3.04±0.53,P<0.05）,腹型HSP（3.35±0.60 vs 2.90±0.70,P<0.001）,关节型HSP（3.35±0.60 vs 3.02 ±0.62,P<0.01）,混合型HSP（3.35±0.60 vs 2.95±0.74,P<0.0001）。在Ace指数方面,健康对照组比单纯型HSP（540.12±90.52 vs477.99±74.55,P<0.01）,腹型HSP（540.12±90.52 vs 494.47±92.93,P<0.05）,关节型HSP（540.12±90.52 vs 474.14±83.86,P<0.0001）,混合型HSP（540.12±90.52 vs 478.6±104.29,P<0.0001）。在Chao指数方面,健康对照组比单纯型HSP（518.41±87.29 vs433.29±74.53,P<0.0001）,腹型HSP（518.41±87.29 vs 438.76±93.87,P<0.0001）,关节型HSP（518.41±87.29 vs 432.62±77.29,P<0.0001）,混合型HSP（518.41±87.29 vs 432.16±104.13,P<0.0001）。由以上结果可知,除肾型HSP患儿外,其他分型的HSP患儿均存在肠道菌群多样性和丰度的显著降低。在分析了菌群α-多样性之后,随后,我们利用PCoA分析了菌群的结构。结果表明,HSP患儿肠道菌群结构与健康对照有较大差异,Anosim分析结果表明,两组间菌群差异具有统计学意义（r=0.228,P=0.001）。我们进一步分析了HSP各分型与健康对照的菌群结构差异,发现各分型间菌群结构没有明显差异（Anosim分析,P>0.05）,但是Anosim分析结果表明,与对照组相比,各组间菌群差异具有统计学意义（r=0.16,P=0.001）。菌群组成是肠道菌群研究的重要内容,在菌群多样性分析的基础上,我们对HSP和健康对照的菌群组成进行了比较。首先,我们分析了两组样本包含的OTU数目,其中,HSP组共包含1740个OTU,而对照组共包含1675个OTU。进一步分析发现,两组中共有的OTU数为1672个,HSP组中独有的OTU数为68个,而健康对照组独有的OTU仅有3个。对各OTU进行聚类后分析发现,在门水平,两组均主要由三个门构成,主要为拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门。多组的门水平结果也表明,各HSP分型也主要由拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门构成。属水平的分析结果表明,HSP组成中主要成员（平均含量大于1%）包括:Bacteroides,Faecalibacterium,Prevotella9,Parabacteroides,Escherichia-Shigella,Parasutterella,Phascolarctobacterium,Alistipes,Megamonas,Lachnoclostridium,Veillonella和Enterococcus。对照组的主要成员（平均含量大于1%）包括:Bacteroides,Faecalibacterium,Prevotella 9,Parabacteroides,Escherichia-Shigella,Parasutterella,Phascolarctobacterium,Christensenellaceae R-7group,Alistipes,Roseburia,Dialister,Lachnospiraceae NK4A 136group和Sutterella。我们还分析了不同分型HSP肠道菌群主要组成成分,结果表明不同分型的菌群组成有明显的差别。我们进一步构建了不同分型HSP菌群群落Heatmap图,经对比发现,不同HSP分型患儿肠道菌群存在较大差异,比如Roseburia,Dialister,LachnospiraceaeNK4A136grou4等属在健康对照中显著增加,而Escherichia-Shigella,Megamonas等在健康对照中显著降低。由上述分析可知,HSP患儿及其不同分型与健康对照在肠道菌群组成方面各不相同,为了进一步进行区分,我们利用LefSe技术对菌群组成差异进行了比对分析,结果发现,HSP组中Enterobaceriales,Selenomonadales和Fusbbacteriales目中的微生物显著增加,在属水平上,Parabacteroides,Parabacteroides,Enterococc as,Veillonella,Anaerostipes,Megasphaera,Enterbacter和 Streptococcus显著增加（LDA>3.0）。健康组在Clostrideales,Burkholderiales和Pasteurellales目的微生物增加,在属水平上,ChristensenellaceaeR-7group,Roseburia,Dialister,LachnospiraceaeNK4A136group,Parasutterella,Pasteurellales,Lachnospira,Haemophilus等属微生物显著增加（LDA>3.0）。在此基础上,我们进一步分析了各亚型之间显著富集的微生物。单纯型HSP患儿中,Megamonas Prevotellacear NK383lgroup和Paraprevotella属微生物显著增加（LDA>3.0）。腥型HSP患儿中Enterococcus,Veillonella,Streptococcus,unclassifiedolactobacillales,Klebsiella,Weissella,Prevotella 7,Abiotrophia和Barnesiella属的微生物显著增加（LDA>3.0）。关节型HSP患儿中Bacteroides和inaerostipes属微生物显著增加（LDA>3.0）。肾型HSP患儿中RuminococcaceaeUCG002,gunclassifiedflachnospiraceae,gEubacteriumruminantiumgroup和g Ruminococcus torquesgroup属微生物显著增加。混合型HSP中未见LDA值大于3的特征均属,不过其中gnorankfErysipelotrichaceae,Provetella2,Acidaminococcus和Lachnoanaerobaculum属微生物显著增加（LDA>2.0）。由于HSP和健康对照的肠道菌群具有显著的差异,因此我们尝试寻找可以将两者区分开来的标志物。我们首先利用机器学习中的随机森林模型（Random Forest）,构建决策树,来筛选可用于区分两组的OTU序列,并筛选出50个可用于区分的标志物,然后利用筛选出的标志物构建ROC受试者工作曲线,得到的ROC曲线其AUC为0.95,说明该模型具有较高的准确性,该模型的敏感度和特异度分别为97.1%和82.7%。同时,我们从50个标志物中挑选了差异最大的前20个的OTU,并利用其构建了ROC受试者工作曲线,其AUC为0.96,说明该模型具有较高的准确性,同时,该模型的敏感度和特异度分别为89.3%和90.7%,具有较高的诊断效率。进一步的,我们从50个标志物中挑选了丰度前10位的OTU,并利用其构建了ROC受试者工作曲线,由图中可知,AUC为0.94,说明该模型仍具有较高的准确性,同时,该模型的敏感度和特异度分别为90%和87.6%,仍具有较高的诊断效率。HSP患儿存在显著的免疫紊乱,包括IgA和IgE等的升高,为此,我们利用相关性Heatmap分析,研究了混合型HSP患儿肠道菌群与临床指征的联系。结果发现住院天数（Length of hospital stay,LOS）与菌群中Roseburia属（r=-0.233,P<0.05）和Paraprevotella属（r=-0.245,P<0.05）微生物数量呈负相关。血清IgA与菌群中的Bifidobacterium属（r=-0.341,P<0.01）微生物数量呈负相关。血清IgM与Escherichia-Shigella（r=-0.234,P<0.05）,Enterococcus（r=-0.28,P<0.05）和norankfErysipelotrichaceae属（r=-0.257,P<0.05）微生物呈负相关。血清IgE与Escherichia-Shigella（r=-0.222,P<0.05）,Megamonas(r=-0.222,P<0.05 和Roseburia（r=-0.256,P<0.05）呈负相关,而与Parabacteroides（r=0.287,P<0.05）和[Eubacterium]coprostanoligenesgroup（=0.287,P<0.01）属微生物数量呈正比。IgG与Coprobacter属（r=0.335,P<0.01）微生物数量呈正比。研究结论:1、本研究结果表明,过敏性紫癜患儿肠道菌群在组成和结构方面均与健康儿童存在显著差异。2、除肾型HSP外,不同亚型过敏性紫癜患儿的肠道菌群在组成和结构方面均较为相似。3、肠道菌群生物标志物可以用于HSP和健康儿童的鉴别区分,且诊断效率较高。4、肠道菌群与HSP患儿临床指标具有相关性,可能与其在HSP发病机制中的作用相关。