沙门菌是在养殖动物中常见的重要的人畜共患病原菌。近年来,有许多关于鼠伤寒沙门菌单相变异体的报道,自21世纪以来,在中国和全球其他部分国家,沙门菌4,[5],12:i:-已经成为导致人类沙门菌病中最常见的血清型之一,并且该血清型的检出率不断地上升,还引起了多次较为严重的沙门菌病的爆发。该血清型与鼠伤寒沙门菌具有相似的抗原性和基因型,但缺乏H2相鞭毛抗原基因。目前,沙门菌4,[5],12:i-在国内的分离率越来越高,而且,大多数都以多重耐药的形式出现。在该研究中,共分离鉴定了 255株沙门菌4,[5],12:i:-和208株鼠伤寒沙门菌为实验菌株,并通过测定其对19种抗菌药物的最小抑菌浓度,分析沙门菌4,[5],12:i:-的耐药性以及多重耐药的情况;随后根据不同地区、宿主来源以及耐药表型,筛选出其中的123株沙门菌4,[5],12:i:-和114株鼠伤寒沙门菌进行全基因组测序,分析两种菌株在耐药基因的类型和数量上的差异,并对耐药基因型与耐药表型的对应关系进行分析,深入研究部分菌株对应性不佳的原因。本研究将有助于进一步分析了解沙门菌4,[5],12:i:-的耐药性、耐药特征、多重耐药情况以及相关的耐药机制。1.沙门菌4,[5],12:i:-耐药性检测与分析本实验室保存以及分离的255株沙门菌4,[5],12:i:-分别来源于2010-2018年中国十个省份的不同宿主,然后对其最小抑菌浓度进行检测,结果显示菌株对TET的耐药率最高,达到了 90.6%,其次为 AMP(86.7%)、AMC(85.5%);菌株对 STR、NAL、CHL、SXT 处于中等耐药水平,都在50%以上;对CFZ、GEN、KAN、OLA、ATM的耐药率在19.6%-42.7%之间;而体外抑菌效果较好的抗生素是FOS、CL和NIT,耐药率都在10%以下;未检测到MEM和AMK的耐药菌株。沙门菌4,[5],12:i:-分离株根据不同环节来源分为养殖环节、屠宰环节、市场环节和人源环节,因此对不同环节的沙门菌4,[5],12:i:-耐药性进行分析,总体来看,四个环节的菌株都对TET、AMP和AMC耐药,并处于一个较高的耐药水平,达到80%以上,这与总体耐药情况相同,从养殖环节-屠宰环节-市场环节-人源环节来看,KAN、GEN、SXT的耐药率呈现逐渐下降的趋势,而NIT,只在屠宰环节中检测出耐药菌株,CL和FOS,只在养殖环节和屠宰环节中检测出耐药菌株,而MEM和AMK均未在此四个环节中检测出耐药菌株。总体而言,不同环节的沙门菌4,[5],12:i:-对AMP、TET和AMC的耐药率与总体的耐药水平相似,养殖环节和屠宰环节的耐药率要高于市场环节和人源环节。沙门菌4,[5],12:i:-的多重耐药现象较为严重,多重耐药率达到了 91.8%,其中鸡源、猫源、鹅源和人源的菌株都表现为多重耐药现象,猪源的多重耐药率达到91.0%。在不同环节中,人源的多重耐药率最高,为96.4%。另外发现从养殖环节到人源环节中,总体的多重耐药率呈现先下降后上升的趋势,此结果要远高于鼠伤寒沙门菌的多重耐药率(65.4%)。在多重耐药菌株中,有43株与西班牙株系(ACSuGSTTm)较为相似的多重耐药克隆谱系,38株与美国株系(ACSSuT)较为相似的多重耐药克隆谱系,6株与欧洲株系(ASSuT)较为相似的多重耐药克隆谱系,除此之外,存在较为普遍的多重耐药克隆谱系为AST和ACTSxT,分别有54株和42株。2.沙门菌4,[5],12:i-耐药基因型与表型对应性研究本研究通过筛选对123株沙门菌4,[5],12:i:-和114鼠伤寒沙门菌进行全基因组测序,检测其耐药基因的分布。经过数据比对,结果显示共检测出8类主要的耐药基因,分别为β-内酰胺类耐药基因(blaTEM-1A、blaTEM-1B、blaTEM-18、blaCTX-M-27、blaTCX-M-14、blaTCX-M-55、blaTCX-M-65、blaOXA-1、blaOXA-10、blaDHA-1、blaNDM-5 和 blaCMY-2),磺胺类耐药基因(sull sul2、dfrA12、dfrA14、dfrA17、dfrA27和sul3),磷霉素类耐药基因只检测到fosA3和fosA两种,四环素类耐药基因(tetA、tetB和tetM),酰胺醇类耐药基因(catB3、catB3、floR、cmlA1、catA1和 catA2),喹诺酮类耐药基因(qnrS1、qnrS2、qnrB6、oqxAB和aac(6’)-Ib-cr),氨基糖苷类耐药基因(strA、strB、aadA1、aadA2、aadA5、aadA8、aadA16、aadA17、aadA24、aac(6)-Iaa、aac(3)-IVa、aac(3)-IId、aph(3)-IIa、aph(3)-Ia、aph(3)-Ib、aph(3’")-7b、apH(4)-Ia、aph(6)-Id、aph(3)-Iva和aac(6’)Ib-cr)粘菌素类耐药基因(mcr-7)。总体来看,沙门菌4,[5],12:i:-中共检测到50种耐药基因,鼠伤寒沙门菌中共检测到51种耐药基因。从耐药基因的携带数量来看,有27.6%的沙门菌4,[5],12:i:-携带7种耐药基因,有40.7%的沙门菌4,[5],12:i:-携带15种以上的耐药基因;而在鼠伤寒沙门菌中,有37.7%的菌株未携带耐药基因或只携带一种耐药基因,有24.6%的菌株携带15种以上的耐药基因,因此,从以上结果对比来看,沙门菌4,[5],12:i:-所携带的耐药基因比例要远高于鼠伤寒沙门菌,这暗示了沙门菌4,[5],12:i:-对食品安全和人类健康比鼠伤寒沙门菌有着更大的潜在威胁。从耐药基因型与表型的对应关系来看,基因型与表型的对应性关系较好,blaTEM-1B基因与青霉素类药物AMP和AMC的符合率达到98.6%和100%,strA和strB基因和氨基糖苷类药物STR的符合率为92.5%和93.8%,tetB基因和四环素类药物TET的符合率达到100%,sul3和dfrA12基因与磺胺类药物SXT的符合率为97.9%,floR基因与酰胺醇类药物CHL的符合率达到了 98.3%,fosA3基因与磷霉素类药物FOS的符合率为87.5%,均表现出优良的对应性。而菌株对喹诺酮类药物表现耐药主要是由gyrA点突变造成的,同时aac(6’)-Ib-cr和oqxAB基因的存在也降低了菌株对喹诺酮类药物的敏感性。但是仍然存在对应性不佳的菌株,对于携带耐药基因却对抗生素表现敏感的现象被称为“phantom resistome”,这暗示着我们仍然有一些未知的耐药基因或者耐药机制未被挖掘。经分析发现,存在的优势多重耐药菌株系为AST和ACTSxT,其对应的多重耐药基因型为blaTEM-1B-strA-strB-tetB和blaTEM-1B-floR-sul2-tetB-dfrA12。还有与西班牙株系相似的多重耐药表型为ACSGTSxT,其对应的基因型为blaTEM-1B-floR-sul2-aph(4)-Ia-strA-strB-tetB-dfrA12,与美国株系相似的多重耐药表型为ACSTSxT,对应的基因型为blaTEM-1B-floR-sul2-strA-strB-tetB,与欧洲株系相似的多重耐药表型为ASTSxT,对应的基因型为blaTEM-iB-strA-strB-sul2-tetB。对123株沙门菌4,[5],12:i:-的质粒型进行分析发现,共检测出12种质粒型,分别为IncQ1、IncY、IncHI2/IncHI2A、p0111、IncFIA、IncFIB、IncHI1A/IncHI1B、IncI1、IncI2、IncFII、IncA/C2和IncR。其中以IncQ1和IncHI2/IncHI2A在数量上占优势,大多数菌株中携带1-2种质粒型,这与鼠伤寒沙门菌有所差异,在鼠伤寒沙门菌中,主要以IncFIB和IncFII在数量上占优势,且大多数菌株携带2-3种质粒型。对于MLST分型结果,98.4%的沙门菌4,[5],12:i:-的MLST型为ST34,并发现了两株新的ST型,而鼠伤寒沙门菌的ST型分布较为广泛,其中主要以ST19为主。