研究背景:随着电离辐射的日益广泛应用,开发低毒高效的辐射防护剂迫在眉睫。近年来,NF-κB逐渐成为辐射防护领域的研究热点,对其激活可诱发细胞多种促存活事件,对正常组织产生辐射防护作用。然而,激活NF-κB还可引发炎症因子爆发、肿瘤细胞能量代谢改变等诸多反应。因此,如何驾驭NF-κB使其发挥对正常组织的辐射防护作用,避免其副作用,增强肿瘤放疗效果,引起了我们的研究兴趣。研究表明,通过TLRs受体激活NF-κB可以很好地实现这一目的。因此,本课题第一部分围绕新型TLR4激动剂MPLA对小鼠多器官辐射损伤防护效应及机制展开了研究。此外,还针对MPLA对肿瘤细胞放射敏感性的影响进行了检验。在第二部分中,则主要围绕IR对癌细胞NF-κB相关代谢关键酶ACSL家族的影响、Acsl6在调节肿瘤放疗敏感性方面的重要作用及其分子机制、MPLA联合敲除Acsl6基因提高肿瘤细胞放射敏感性等几个方面展开了深入研究。研究目的:1.明确MPLA体内外辐射防护效应2.探索MPLA辐射防护作用的分子机制3.检测MPLA对肿瘤细胞放射敏感性的影响4.对癌细胞照后不同ACSL同工酶转录水平变化进行筛选5.验证Acsl6敲除提高肿瘤细胞放射敏感性的作用6.探究Acsl6敲除放射增敏机制7.初步验证MPLA联合ACSL6敲除可提高肿瘤放疗效果研究方法:1.细胞培养与处理:采用HUVEC,L02,RAW264.7,LLC和RM9细胞。MPLA给药实验于IR前12小时加药（1μg/ml用DMSO溶解）,对照组给予相应剂量DMSO。2.实验动物:动物实验采用6—8周龄的野生型C57BL/6小鼠,TLR4（-/-）小鼠以及TRIF突变型小鼠(TRIF^mutant)。MPLA给药以生理盐水溶解,剂量为1μg/mouse,0.1ml/mouse,方式为灌胃强饲,时间为IR前12h。3.γ射线照射:第一部分采用海军军医大学辐照中心Co⁶⁰-γ射线照射源;第二部分采用美国德州大学西南医学中心放射肿瘤学部分子放射生物学系¹³⁷Cs-γ射线照射源。4.细胞活力检测:采用CCK-8法检测细胞活力。5.凋亡检测:采用Annexin V/PI双染法以流式细胞术检测细胞凋亡。6.细胞周期检测:应用PI单染法检测,FlowJo软件分析。7.动物取材:照后不同时间点处死小鼠,分离组织,制作单细胞悬液。8.彗星电泳实验:采用玻片双层凝胶法以中性细胞电泳进行。9.Western Blot:参照WB实验一般流程进行。10.ELISA实验:采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测小鼠血清细胞因子。11.组织学检测:采用石蜡切片+H&E染色法对动物组织进行组织学检测。12.p65、γ-H2AX免疫荧光分析:主要步骤:制作细胞爬片、施加处理因素、固定、穿膜、封闭、孵育一抗二抗、封片、观察分析。13.NF-κB荧光素酶检测:经过构建NF-κB基因与荧光素酶基因的融合质粒,转染后以荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测。14.克隆形成实验:所有克隆形成实验均采用直径为6cm的细胞培养皿进行细胞培养、血球计数板进行细胞计数（以确保细胞分散良好）、先铺板后照射、无水乙醇固定、结晶紫染色、Oxford Optronix细胞群落计数器自动计数（确保计数客观）、SigmaPlot 13.0分析作图（LQ模型拟合生存曲线）。15.qRT-PCR实验:主要步骤:总RNA抽提、逆转录cDNA、实时荧光定量PCR。16.Acsl6 KO细胞的构建:我们以CRISPR Cas9技术构建KO细胞系,最后经过有限稀释法筛选稳定敲除了目的基因的细胞株。17.Acsl6 KO Rescue细胞株构建:首先构建含有FLAG和Acsl6 cDNA的质粒,经过转化、克隆筛选、质粒扩增与鉴定,将得到目的质粒转染进入LLC细胞,用G418进行施压、筛选,最后以WB进行蛋白鉴定。18.细胞糖酵解检测:采用Cayman的L-Lactate检测试剂盒,通过比色法检测细胞外L-乳酸的水平进而反映细胞糖酵解程度。19.ROS检测:本实验主要采用了CM-H2DCFDA试剂盒进行ROS标记染色,并以流式细胞术检测荧光信号来反应待测细胞ROS水平。20.AVOs染色细胞自噬检测:采用吖啶橙染色法标记酸性自噬小体、裂解小体等,结合荧光显微镜拍照以及流式细胞仪定量的方法完成。21.统计分析:应用Excel、SPSS 21对数据进行统计分析,以GraphPad Prism 6、SigmaPlot 13.0进行绘图。两组间比较用两独立样本的t检验进行,P值小于0.05认为其具有统计学意义。研究结果:一、MPLA辐射防护作用及机制研究1.MPLA可以有效减轻IR所致细胞凋亡,促进细胞照后DNA损伤修复凋亡检测发现MPLA显著降低了IR引起的细胞凋亡;而细胞周期检测显示MPLA有效降低了IR导致的G2/M期周期阻滞;彗星电泳实验显示MPLA有效减少了IR所致细胞核拖尾程度,且OTM和TM值均显著降低。2.MPLA对照后小鼠体内造血系统的辐射防护作用IR引起了小鼠骨髓空虚化且损伤程度呈进行性加重,骨髓有核细胞计数于照后第三天显著降低,而MPLA明显改善了这些损伤情况。同时,MPLA提高了照后小鼠B220^-且CD34⁺骨髓细胞的比例。3.MPLA对小鼠脾脏具有TLR4依赖的辐射防护作用IR引起了小鼠脾脏白髓面积、数目明显缩小,而MPLA能够有效增加其白髓范围;脾细胞凋亡检测结果显示,MPLA能够明显降低辐射引发的脾细胞凋亡率,并且有效扭转了IR引发的脾细胞CD4⁺/CD8⁺比例失调。然而,这些MPLA对脾脏的辐射防护效果并未出现在TLR4-/-小鼠中,说明了该效应依赖TLR4而发挥。4.MPLA可减轻小鼠的睾丸、小肠辐射损伤,提高照后动物生存率MPLA显著改善了睾丸、小肠的组织学辐射损伤;且有效提高了不同致死剂量、不同照射方式下的动物生存率。5.MPLA的辐射防护作用依赖于TLR4我们以TLR4-/-小鼠为研究对象,发现MPLA未能扭转IR对骨髓、脾脏等造成的组织学损伤,不能改善骨髓有核细胞、脾细胞等的辐射损伤,说明MPLA的辐射防护作用依赖于TLR4受体而发挥。6.MPLA激活TLR4后启动MAPK信号通路（p38途径）并且提高了NF-kB p65核转位及其转录活性通过WB实验,我们发现MPLA促进了IKK-β的磷酸化,而免疫荧光实验显示MPLA诱导了明显的NF-κB p65核转位,与此同时,荧光素酶检测提示MPLA显著提高了细胞内NF-κB转录水平。7.MPLA主要通过Myd88介导TLR4信号通路转导以RAW264.7为研究对象,通过siRNA分别敲低TRIF以及Myd88基因,检测细胞凋亡。MPLA显著降低了IR引起的WT及TRIF KD细胞的凋亡率,而对Myd88KD细胞无保护作用。此外,通过对TRIF^mutant小鼠组织学检测发现,MPLA仅部分改善了IR造成的骨髓细胞缺失,而对脾脏组织结构损伤无影响。8.MPLA可改善IR引起的高炎性状态以及Th1/Th2免疫失衡以ELISA法检测不同处理组小鼠血清细胞因子含量。结果显示,MPLA+IR组中IL-6及TNF-α水平相对于IR组显著降低;进一步研究发现,MPLA能够改善IR造成的小鼠Th1/Th2免疫失衡。9.MPLA对LLC、RM9辐射敏感性的影响以LLC、RM9为研究对象,通过平板克隆形成实验检测MPLA对癌细胞辐射敏感性的影响。结果显示,MPLA均未增加两种肿瘤细胞辐射抗性。二、ACSL6对肿瘤细胞放射敏感性的影响及其分子机制研究1.ACSL系列同工酶对肿瘤细胞放射生物学反应的影响筛选通过qRT-PCR的手段分别对LLC及RM9 IR之后ACSL五种同工酶基因转录水平进行检测,发现只有Acsl6基因在IR之后48h显著上调;对于LLC,IR之后24h即出现了Acsl6的明显增高。2.构建Acsl6敲除细胞系利用CRISPR Cas9技术对LLC、RM9细胞成功进行了Acsl6基因的敲除以及稳定敲除细胞株的筛选。3.Acsl6 KO显著降低了肿瘤细胞IR之后克隆形成能力以LLC、LLC KO1、LLC KO3、RM9以及RM9 KO为研究对象,行克隆形成实验检测细胞的放射敏感性变化。结果显示,所有基因敲除组细胞克隆形成能力明显降低。4.Acsl6 KO参与LLC细胞Warburg效应的调节利用比色法检测了细胞外L-乳酸含量,以反映细胞的有氧糖酵解水平。实验结果显示,将Acsl6敲除之后,LLC在IR之后2h、24h的乳酸水平显著降低。然而,RM9细胞并未出现此现象。5.Acsl6 KO活化了LLC中能量代谢调控因子AMPK,但对RM9未产生明显影响AMPK可以负向调节Warburg效应,二者之间存在着紧密联系。我们以WB实验检测AMPK在各细胞株的磷酸化情况,发现在未照射或者10Gy照后,LLC KO1细胞在24h、48h时AMPKα磷酸化水平都显著上调,而此现象未出现在RM9细胞中。6.Acsl6 KO增加了γ-H2AX焦点的形成我们以LLC、LLC KO1、RM9、RM9 KO等细胞株为研究对象,行γ-H2AX免疫荧光实验。Acsl6敲除后使LLC、RM9核内γ-H2AX焦点数目都显著增加,反映了其DNA损伤修复能力的降低。7.Acsl6 KO通过AMPK-P53通路提高癌细胞内P53磷酸化水平及总P53浓度WB结果显示,Acsl6敲除后显著提高了LLC、RM9内P53磷酸化水平。IR提高了LLC中P53磷酸化水平,而敲除组细胞中升高更为明显,P53总量也显著上升;升高的磷酸化P53均可被ATM抑制剂KU-55933所阻断,而后者反而增加了AMPK的磷酸化水平。8.Acsl6 KO提高了LLC及RM9细胞内的ROS水平ROS检测发现LLC KO1和RM9 KO组CM-H2DCFDA波峰发生了明显的右偏移,其量化结果也显示敲除组细胞内ROS水平较WT组显著增高。9.Acsl6 KO促进了LLC细胞周期G1阻滞细胞周期检测发现敲除Acsl6基因后显著提高了LLC在IR之后16h、24h及32h的G1周期阻滞水平,而在2h和8h未发现显著差异。同时,我们发现这一现象并未出现在RM9中。10.Acsl6 KO增加了LLC及RM9的细胞自噬水平首先通过WB检测了各组细胞IR后LC3Ⅰ-Ⅱ的转化水平。实验显示Acsl6 KO提高了两种细胞的自噬水平,但以LLC更为迅速（IR后24h）。随后,行AOVs染色对细胞自噬进一步研究,得到了趋势一致的结果。11.Acsl6 KO基因回转细胞系的构建及其放射敏感性研究我们成功构建了Acsl6基因敲除回转的LLC KO Rescue2细胞株,行克隆形成实验,结果显示将Acsl6基因回转到敲除细胞株之后,其照后克隆形成能力显著回升。12.MPLA联合敲除Acsl6对LLC放射敏感性的影响以LLC及LLC KO1为研究对象,分别以DMSO、MPLA处理,IR后进行克隆形成实验,结果显示LLC KO1+MPLA组克隆形成能力最弱。研究结论:基于激活NF-κB而发挥辐射防护作用的TLRs激动剂在放射生物学领域已经得到了广泛重视,同时也是本室长期关注、重点研究的课题之一。本课题分为两个部分,分别对MPLA辐射防护作用及ACSL6敲除放射增敏进行了研究:第一部分中,我们首次发现并证实了新型TLR4激动剂MPLA能够有效发挥多器官低毒高效的辐射防护作用,并且较为明晰地揭示了其所依赖的“TLR4-Myd88-MAPK（p38）-NF-κB-纠正TH1/Th2、炎症因子调节”信号通路。此外,我们初步证明了MPLA直接作用于癌细胞不增加其辐射抗性。第二部分中,首次发现了IR能够诱发癌细胞Acsl6基因转录特异性上调;而敲除该基因之后,显著增加了癌细胞的放射敏感性;进一步研究发现,ACSL6调控癌细胞放射敏感性机制与Warburg效应、ROS、自噬、G1阻滞及DNA损伤修复通路等紧密相关;并且,MPLA联合敲除ACSL6基因提高肿瘤放疗效果展现了良好的前景,提供了诸多新型分子靶点。