生物传感器具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂体系中进行在线连续监测等优点,在化学、生物医学、环境监测、食品、医药和军事等领域有重要的应用价值。有效的生物活性组分的固定方法是构建性能优良生物传感器的关键。纳米结构的材料具有独特的光学、电学和催化特性及良好的生物相容性。将纳米材料应用于生物传感器的制备和生化分析可以较大提高传感器的响应性能。　　 核酸适体(Aptamer)是一类使用人工合成从含大量自由序列的核酸文库中通过体外筛选分离出来的能以高亲合力与各种靶分子(小分子、蛋白质,甚至整个细胞)特异性结合的核酸序列。在生化分析领域,核酸适体由于具有与目标结合的高特异性和强亲和力,以及生物活性稳定,易于合成和保存等优点而成为一种极富应用潜力的识别探针。将核酸适体应用于各种蛋白质及小分子检测系统的构建,为生化检测方法与生物传感器的研究提供了一个新的平台。　　 另外,人类的许多遗传性疾病都是由于基因的变异引起的,其中尤以单碱基的突变,即单核苷多态性(SNPs)最为普遍。实现对这些基因单碱基突变的早期、准确、简便、快速的确认,对于人类相关疾病的发病机理研究及早期治疗具有非常重要的意义。目前,有关单碱基突变的检测方法已有许多报道。而这些传统的方法要么仪器昂贵、操作繁琐、要么检测灵敏度偏低,因此急需开发一些简便、廉价、精确、灵敏且易于临床推广的方法。　　 基于以上考虑,综合文献报道,本文主要在传感器传感界面构建新方法和提高生化分析的检测灵敏度方面做了一些工作,主要内容如下:　　 (1)纳米金协同的生化分析方法研究。利用金纳米颗粒特殊的光学和电学性质及其具有良好生物相容性的特点,在第2章提出了一种基于壳聚糖和纳米金标记的新型免疫分析方法。壳聚糖含有大量的氨基基团,容易对其做进一步的化学修饰,通过戊二醛交联,可以将抗体共价固定到(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷衍生的载玻片上。与抗原反应之后,将所得载玻片浸入到纳米金标记的抗体中就可生成可检测的信号。这两个步骤交替重复三次,通过抗原抗体特异性反应形成纳米金多层,由此希望达到信号放大的目的。利用紫外可见分光光度计可以特异性地对模型分析物人血清白蛋白进行检测。由于紫外可见分光光度计仪器本身检测灵敏度的限制,使用这种方法其检测下限只能达到2.0μg/mL。为了进一步提高检测灵敏度,在第3章我们发展了一种基于二茂铁标记和邻苯二胺电聚合膜/纳米金放大高灵敏检测免疫物质的电化学方法。首先在金电极表面修饰一层聚邻苯二胺的电聚合膜,为传感界面的构建提供了一个富含氨基的稳固基底。用戊二醛作为交联剂,将胱胺偶合在修饰电极表面后,金纳米颗粒通过自组装修饰到所得电极表面。利用金纳米颗粒的独特性质,抗体可以通过氨基.金的亲和力固定到纳米会粒子上,并具有高的负载量和高的免疫活性。引入模型分析物后,二茂铁标记的抗体通过抗体.抗原的特异反应结合到传感界面上,产生氧化还原信号,峰值与分析物的量成比例关系。在优化的实验条件下,我们提出的检测方法其检测下限可低至10pg/ml,实现了对免疫物质的高灵敏检测。随后,我们还将金纳米颗粒应用于核酸和小分子的检测,希望实现高灵敏和快速检测的目的。在第4章,提出了一种基于纳米金荧光淬灭的一步均相DNA杂交检测的新方法。纳米金颗粒表面修饰有5’端硫基修饰的寡核苷酸链(纳米颗粒探针序列),该核苷酸链3’端标记着带负电荷的荧光染料分子FAM。FAM标记的探针序列与同带负电荷的纳米金颗粒之间的静电相斥作用使得纳米颗粒探针序列保持伸展状态。体系中加入互补的目标序列与探针序列杂交使得探针序列从原来的伸展型转换成拱状型,从而使荧光基团与纳米金颗粒靠近。结果荧光被纳米金颗粒有效地淬灭,荧光淬灭效率与目标序列的浓度相关,由此可实现对样品中的目标序列的定量检测。基于金纳米颗粒受表面电荷等周围环境因素影响容易团聚的原理,在第5章发展了一种新型非标记的过氧化氢比色检测系统。将H2O2加入邻苯二胺(O-PDA)/辣根过氧化物酶(HRP)的溶液中。反应充分后再加入纳米金溶液,混合溶液颜色由红色快速地变为蓝色,且在420nm处有明显的吸收峰。这是由于在辣根过氧化物酶的催化下,邻苯二胺被过氧化氢氧化,生成偶氮苯,进而引发纳米金颗粒的团聚。纳米金的团聚程度与420nm处吸收峰的强度均随H2O2浓度增加而增大。用这种方法检测H2O2,用肉眼直接半定量分析其检测下限为10μM,用紫外可见吸附光谱法定量检测,检测下限可达0.6μM。该法简便有效,同样适用于其他物质的检测,如葡萄糖,胆固醇等等,为新型生化检测系统的研制提供了新思路。　　 (2)基于滚环放大的生化分析方法研究。利用连接.滚环放大反应系统可在恒温下获得大量与环形模板互补的重复序列这一特点,在第6章提出了一种基于连接.滚环扩大和嵌入亚甲基蓝的非标记、高灵敏的单核苷多态性检测方法。通过连接酶识别目标.DNA上的点突变而产生的环形模板,在恒温下可以通过Phi29DNA聚合酶进行扩增,所得延伸产物与固定在金电极上的捕获探针杂交。以亚甲基作为嵌入剂检测其氧化还原峰可判断突变的发生。利用Phi29 DNA聚合酶的高放大效率和大肠杆菌DNA连接酶对连接位点突变碱基识别的高精确性,可以检测到40amol的突变链,野生型和突变型浓度比为5000:1时仍可以检测出明显的电流变化,说明此方法具有高灵敏度和高保真度。并且,该传感器无需标记,容易再生,可作为单核苷多态性基因分型的良好选择。同时,在第7章,我们还将连接-滚环放大这一系统利用光学的方法应用于蛋白质的检测。该方法主要依赖于目标蛋白,适体探针和与适体探针匹配的互补序列之间的竞争反应。在不含目标蛋白时,适体探针与互补序列杂交形成适体探针/互补序列的二元复合物,这样互补序列就不能与挂锁探针杂交从而不能进行连接.滚环放大反应。相反,有目标蛋白存在时,适体探针与目标蛋白特异性结合形成适体探针/分析物复合物,使得互补序列可以与挂锁探针杂交。在DNA连接酶的作用下,挂锁探针被进一步环化并在Phi29DNA聚合酶的作用下通过滚环放大反应进行扩增。其产物包含成千上万个可以和分子信标检测探针互补杂交的重复序列。以PDGF.BB为模型分析物,可以检测到1.36amol的蛋白质分子。而且,该方法只需根据目标蛋白和其适体序列的不同设计不同的互补序列和挂锁探针就可以实现对其他蛋白质的检测。　　 (3)非额外信号放大的高灵敏生化分析方法研究。第8章利用分子间的G-四股螺旋结构,不需任何信号增强试剂,构建了高灵敏的电化学DNA生物传感器。为了获得传感界面,通过巯-金键作用将捕获探针(巯基DNA序列)组装到金电极表面;用具有电化学活性的二茂铁分子衍生末端富G-片段的DNA序列,作为信号报道探针,这条探针设计成能够形成分子间的四股螺旋,且与捕获探针序列相匹配。信号探针与表面限定捕获探针的杂交能使电极产生氧化还原峰电流。少量的目标DNA与捕获探针的预先杂交能够使电极的峰电流发生显著变化,产生电化学响应信号。用这种竞争杂交型的电化学检测方法,其检测下限可低至4.96×10-14M。相对于普通序列探针构建的传感界面,该传感界面具有较高的灵敏度。常见的基于核酸适体的电化学传感器或者采用signal-on或者采用signal-off,但或多或少都有一定的背景信号,这会影响传感器的灵敏度。第9章以腺苷作为检测模型,提出了一种新型的背景消除的电化学核酸适体生物传感器。首先设计一条特定的单链DNA序列。这条单链DNA的5’端和3’端分别修饰有巯基和氨基,通过EDC-NHS的活化可以使3’端修饰上电活性物质二茂铁。这条单链DNA的中间部分包含了一段能特异性识别腺苷的序列。在没有目标物存在时,这条单链DNA形成发夹型的二级结构。其发央的茎干部分包含有大肠杆菌核酸内切酶的酶切位点。在核酸内切酶的作用下,酶切位点被识别,茎干部分形成的双链DNA被切断。固定在金电极上的适体探针由于只有一个互补碱基对,常温下极不稳定,导致3’端二茂铁修饰的DNA片段脱离电极表面。这样就检测不到任何二茂铁的氧化还原电流信号。相反,当体系中有腺苷时,核酸适体与腺苷特异性结合,形成另外一种二级结构。这种情况下没有形成大肠杆菌核酸内切酶的识别位点,适体探针就不会被切断,3’端修饰的二茂铁依然靠近电极表面,这样就能检测到较强的氧化还原电流信号。通过核酸内切酶的特异性识别作用,能够使背景电流信号基本上完全消除,从而大大提高了检测灵敏度。用我们提出的这种方法检测腺苷,不需要其他信号放大试剂其检测下限也可以达到10-13M级别,这远远低于目前文献所报道的腺苷检测限。