狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus,RV)引起的人畜共患病急性传染病。人被RV感染后,一旦出现神经症状,几乎百分之百死亡,我国每年超过1000人死于狂犬病。可见,狂犬病严重威胁人类的健康。随着分子生物学、基因组学和蛋白组学的广泛应用,对RV各蛋白的功能、致病机制、出芽过程的研究取得巨大进展,但依旧没有完全透彻。透彻研究这些机制,将有助于治疗狂犬病药物的开发和免疫疫苗质量的提高。目前,由于缺乏适用的RV单克隆或多克隆抗体,严重阻碍了我们研究的步伐,适用抗体的研制已成为相关研究的前提条件。核蛋白(N)蛋白对病毒的转录复制至关重要,制备N蛋白抗体用于检测N蛋白表达量,继而评价病毒的转录复制能力。糖蛋白(G)是RV的主要保护性抗原,同时它还与病毒的嗜神经性、致病性密切相关,所以制备适用的G蛋白抗体十分必要。N蛋白的主要线性抗原结构区域位于360-383位氨基酸残基。本文以RC-HL N基因质粒为模板,利用两对引物RV-NF1/R1、 RV-NF2/R2分别扩增N1-2(350-410位氨基酸)、N3-4(360-451位氨基酸)两个片段。再利用RV-NF1和RV-NR2两条末端互补的引物和N1-2、N3-4片段胶回收产物进行重叠PCR,扩增出N1-4片段。并将其克隆至pMD18-T载体得到pMD-N1-4质粒,双酶切后亚克隆到pET-32a原核表达载体。转化宿主菌Rosetta并利用IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE分析重组N蛋白,发现主要以包涵体形式表达。重组N蛋白经Ni-NTA亲和层析配合含不同浓度尿素的包涵体洗涤液进行纯化。对纯化后的蛋白进行梯度透析,使其复性重折叠。复性蛋白配合弗氏佐剂按照合理的免疫程序进行小鼠免疫,采集血清制备多克隆抗体。Western blot检测感染RC-HL48h的BHK细胞中N蛋白的表达,出现50.5kd的目的条带；间接免疫荧光实验发现抗体能和N蛋白发生良好反应,检测到特异性荧光。将N蛋白多克隆抗体进行倍比稀释后与感染RC-HL48h的BHK细胞中N蛋白进行反应,发现1：2000是抗体的最佳稀释倍数。G蛋白251位色氨酸(Trp)是线性抗原表位。运用固相多肽Fmoc合成法合成了G蛋白的主要抗原结构区G15-13多肽片段(aa245-264),按照合理的免疫程序免疫小鼠采集血清制备G蛋白多克隆抗体。Western blot检测感染RC-HL48h的BHK细胞中G蛋白的表达,出现56kd的目的条带；间接免疫荧光实验发现抗体能和G蛋白发生良好反应,检测到特异性荧光。