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肠杆菌科细菌对喹诺酮类药物耐药性日益加重，以往喹诺酮类的耐药研究多集中在染色体介导的靶位改变、膜通透性降低、外排泵亢进机制，质粒介导的喹诺酮类耐药罕见报道。qnrA是首次报道的质粒介导的喹诺酮耐药基因，由Martinez-Martinez等在1株肺炎克雷伯菌中检出，作用机制是其编码的蛋白能保护喹诺酮类作用的靶位导致耐药。喹诺酮类是人工合成的药物，一直认为不受修饰酶影响，最近Robicsek等首次报道了喹诺酮类修饰酶基因aac(6’)-Ib-cr，其也位于质粒上，它本质上是一种普通氨基糖甙类乙酰转移酶基因aac(6’)-Ib的变异体，第223和454位两处碱基的突变赋予了其修饰喹诺酮类的特性，但只能修饰含游离氨基的喹诺酮类且仅介导低水平耐药，研究发现该变异体仍能修饰普通型aac(6’)-Ib的底物但作用轻度降低，故其能修饰氨基糖甙类和喹诺酮类两种完全不同类的抗生素而致耐药。本研究以2001-2002年从我市八家医院分离的肠杆菌科临床株着手，研究细菌质粒介导的喹诺酮类耐药机制，为临床合理应用抗生素、控制耐药基因的播散提供理论依据。第一部分耐环丙沙星肠杆菌科临床株中qnrA基因的检测目的：调查2001-2002年天津地区八家医院收集的116株环丙沙星耐药(CPLX MIC≥4ug／ml)的肠杆菌科菌株中qnrA基因的存在状况。方法：1、自2001年3月—2002年12月从天津市八家医院收集116株环丙沙星耐药(CPLX MIC≥4ug／ml)的肠杆菌科临床株，包括大肠埃希菌77株，克雷伯菌属15株，阴沟肠杆菌24株。2、采用琼脂稀释法测肠杆菌科临床株对环丙沙星的MIC，按临床实验室标准委员会CLSI2006年的标准进行判读，质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC25922。3、应用PCR方法调查qnrA基因在肠杆菌科临床株中的分布，阴性质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，qnrA阳性质控菌为肺炎克雷伯菌，由安徽医科大学第一附属医院检验科李涛硕士提供。结果：116株环丙沙星耐药的肠杆菌科临床株中79(68.1％)株对环丙沙星高度耐药(CPLX MIC≥32ug／ml)；116株环丙沙星耐药的肠杆菌科临床株中未发现qnrA基因阳性株。结论：qnrA基因在天津地区肠杆菌科临床株中甚为罕见，qnr样基因的流行状况有待更加细致而全面的研究。第二部分：aac(6’)-Ib-cr基因介导的喹诺酮类耐药机制的研究目的：调查77株环丙沙星耐药的大肠埃希菌(同第一部分)中aac(6’)-Ib基因的存在状况并初步探讨其变异体aac(6’)-Ib-cr介导的喹诺酮类耐药机制。方法：1、应用PCR方法筛查菌株的aac(6’)-Ib基因。2、琼脂稀释法测aac(6’)-Ib阳性菌株对卡那霉素的MIC，按临床实验室标准委员会CLSI2006年的标准进行判读，质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC25922。3、DNA测序检测aac(6’)-Ib-cr基因变异体，从aac(6’)-Ib阳性株中选择对卡那霉素耐药表型不同的部分菌株，其PCR扩增产物送上海生工进行DNA序列分析。4、接合传递试验方法探讨细菌质粒介导的耐药性传递，大肠埃希菌NK5449作为接合传递受体菌株，供体菌株为临床分离株。在含卡那霉素4ug／ml和利福平600ug／ml的LB选择培养基上筛选接合株，有菌落生长为接合成功；为进一步了解有无喹诺酮类和氨基糖甙类的耐药转移，分别测供体株、受体株、接合株对喹诺酮类和氨基糖甙类的MIC。结果：1、aac(6’)-Ib的PCR扩增，77株对环丙沙星耐药的大肠埃希菌中15株检出aac(6’)-Ib，其中对卡那霉素耐药10株、中介4株、敏感1株。2、序列分析，从15株aac(6’)-Ib阳性株中选出对卡那霉素耐药表型不同的6株菌即E13、E14、E40、E60、E74、E75，其中E75为敏感株，E40、E60为耐药株，其余3株为中介株；6株菌的PCR扩增产物进行DNA序列分析，结果表明：E60携带普通型aac(6’)-Ib，其余5株菌在aac(6’)-Ib的第223位和454位均出现点突变即携带aac(6’)-Ib-cr。3、接合传递试验，对6株测序的菌株进行接合传递，其中E13、E14、E40、E60在选择培养基上有菌生长接合成功；药敏结果表明：携带普通型aac(6’)-Ib的菌株E60其接合株与受体株相比，对3种喹诺酮类药物的MIC无差别，而携带aac(6’)-Ib-cr的菌株E13、E14、E40其接合株与受体株相比，对环丙沙星和诺氟沙星(二者含游离氨基)的MIC提高了2个稀释度，对左氧氟沙星的MIC无变化，两种来源的接合株的共同之处在于对卡那霉素和庆大霉素的MIC均比受体株明显提高。结论：1、天津地区大肠埃希菌临床株中首次发现了aac(6’)-Ib-cr基因。2、aac(6’)-Ib-cr对菌株的喹诺酮类和氨基糖甙类抗生素的耐药起到一定的作用，由于耐药基因位于质粒上增加了耐药性水平播散的危险。3、本研究的创新点：第一同时对质粒介导的两种喹诺酮耐药机制进行了研究，本研究对天津地区116株肠杆菌科临床株筛查qnrA未发现阳性株，但其实际流行状况尚待深入调查；首次在天津地区发现了aac(6’)-Ib-cr，国外学者Robicsek首次报道了aac(6’)-Ib-cr并进一步对中国上海大肠埃希菌中该基因的流行状况进行调查，除上海外国内尚无其他地方出现aac(6’)-Ib-cr的报道。第二根据试验结果提出一个假设：庆大霉素等含游离氨基但不被普通型aac(6’)-Ib修饰的氨基糖甙类药物很可能也是aac(6’)-Ib-cr作用的底物，为进一步研究该变异体与普通型的aac(6’)-Ib在功能等方面的差异提供了新的思路。